靶蛋白的放射標記實驗
實驗材料 細胞儀器、耗材 培養基實驗步驟 1. 制備活躍生長著的細胞。從單層培養細胞（約鋪滿 75% 表面積）中吸去培養基。用預熱至 37℃ 的無血清培養基沖洗兩次（培養基中應該不含蛋氨酸和半胱氨酸）。對于懸浮培養細胞，通過 400 g 離心 5 分鐘收集細胞。用頂熱至 37℃ 的無蛋氨酸培養基重懸沉淀，400 g 離心 5 分鐘。盡可能地去掉上清，用無蛋氨酸培養基重懸細胞至 107 細胞/ml 后轉移至一塊小培養板。2. 加入預熱的無蛋氨酸和半胱氨酸的培養基，于 37℃ 培養 20 分鐘，以耗盡胞內含硫氨基酸庫。3. 吸去培養基，立刻換上預熱的、無蛋氨酸和半胱氨酸何含有適量標記氨基酸的新鮮培養基，依據預實驗結果，將細胞于 37℃ 培養一定時間（對于末做過預實驗的蛋白質，以 2~4 小時作為初始值比較合適）4. 移去放射性培養基。對于單層培養細胞，吸出即可。懸浮培養細胞則可轉至試管，400 g 離心 5 分鐘，倒去上......閱讀全文
靶蛋白的放射標記實驗
用[35S]蛋氨酸和[35S]半胱氨酸標記哺乳動物細胞酵母和細菌蛋白質的代謝放射標記實驗材料細胞 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?儀器、耗材培養基 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
靶蛋白的放射標記實驗
用[35S]蛋氨酸和[35S]半胱氨酸標記哺乳動物細胞 酵母和細菌蛋白質的代謝放射標記 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 細胞
靶蛋白的放射標記實驗
實驗材料 細胞儀器、耗材 培養基實驗步驟 1. 制備活躍生長著的細胞。從單層培養細胞（約鋪滿 75% 表面積）中吸去培養基。用預熱至 37℃ 的無血清培養基沖洗兩次（培養基中應該不含蛋氨酸和半胱氨酸）。對于懸浮培養細胞，通過 400 g 離心 5 分鐘收集細胞。用頂熱至 37℃ 的無蛋氨
靶蛋白的放射標記實驗2
用[35S]蛋氨酸和[35S]半胱氨酸標記哺乳動物細胞實驗材料細胞儀器、耗材培養基實驗步驟1. 制備活躍生長著的細胞。從單層培養細胞（約鋪滿 75% 表面積）中吸去培養基。用預熱至 37℃ 的無血清培養基沖洗兩次（培養基中應該不含蛋氨酸和半胱氨酸）。對于懸浮培養細胞，通過 400 g 離心 5 分鐘
靶蛋白的放射標記實驗—酵母和細菌蛋白質代謝放射標記
實驗材料 細胞 儀器、耗材 基本培養基 實驗步驟 1. 接種細胞于只含有必需氨基酸和輔因子的已知成分的基本培養基，于合適溫度中度振蕩培養過夜。 2. 用新鮮的基本培養基稀釋培養物，繼續溫育至 107?細胞/ml （酵母）或對數期中期（細菌）。 3. 5000
DNA印跡雜交分析實驗——放射標記法
雜交分析的原理是特定序列的單鏈DNA分子（即通常標記的“探計”）可與另一個固定了的具有互補序列（“靶”序列）的DNA分子或RNA分子形成堿基配對，雜交分子的穩定性取決于發生堿基配對的程度，這一技術可檢測復雜基因組中的單拷貝基因。實驗方法原理本方案適合于用100~1 000 bp 長的放射性標記的DN
放射性碘標記
在RIA中，標記抗原質量的優劣，直接影響測定結果，必須制備比放射性強、純度高的標記抗原，并保持免疫活性不受喪失。 一、同位素的選擇 同位素有穩定性和放射性兩種。放射性同位素可利用其衰變時放出的放射線進行測量，這種測量較靈敏而方便，故多用放射性同位素。標記抗原，常用的放射性同位素有3H、14C、1
以－RNA－為靶目標－FISH－探針的標記實驗
標記的 RNA、DNA 或者核酸類似物可以通過熒光原位雜交（FISH) 的方法檢測細胞標本內的 RNA。目標 RNA 通常是由基因組 DNA 轉錄來的信使 RNA(mRNA)。由于髙特異的核酸堿基互補配對原則，特定的 RNA 分子可以從眾多共表達的 mRNA 分子中篩選出來。對選擇的 mRN
以－RNA－為靶目標－FISH－探針的標記實驗
標記的 RNA、DNA 或者核酸類似物可以通過熒光原位雜交（FISH) 的方法檢測細胞標本內的 RNA。目標 RNA 通常是由基因組 DNA 轉錄來的信使 RNA(mRNA)。由于髙特異的核酸堿基互補配對原則，特定的 RNA 分子可以從眾多共表達的 mRNA 分子中篩選出來。對選擇的 mRNA 分子
RNA－放射性標記
實驗材料 [α32P]UTP 或 CTP(800Ci ml10mCi ml) UTP 或 CTP T4 多核苷酸激酶(γ32P)ATP 牛小腸磷酸酶T4RNA 連接酶 [32P]pCpATP2Oumol L 無 tRNA 酶的牛血清白蛋白試劑、試劑盒 10XT4 多核苷酸激酶緩沖液 DEPC 處理的
RNA－放射性標記
? ? ? ? ? ? 實驗材料 [α32P]UTP 或 CTP(800Ci ml 10mCi ml) UTP 或 CTP T4 多核苷酸激酶 (γ32P)ATP
放射免疫標記技術
一、放射免疫標記技術放射免疫標記技術是將同位素分析的高靈敏度與抗原抗體反應的特異性相結合，以放射性同位素作為示蹤物的標記免疫測定方法，由于此項技術具有靈敏度高 (可檢測出毫微克(ng)至微微克(pg)，甚至毫微微克(fg)的超微量物質，特異性強(可分辨結構類似的抗原)、重復性強、樣品及試劑用量少
放射免疫技術（RIA）標記抗原實驗的原理和步驟
原理當抗原遇到相應的抗體便形成抗原抗體復合物(Ag+Ab?Ag-Ab)，當用放射性同位素標記抗原再與相應的抗體結合便形成標記抗原和抗體復合物。即：*Ag+Ab?*Ag-Ab。當標記抗原和未標記抗原一起加入相應的抗體時則兩種抗原產生相互的競爭，而生成有標記抗原和抗體復合物以及非標記抗原和抗體復合物。生
放射性標記化合物的標記方法
放射性標記化合物的常用標記方法有化學合成法、同位素交換法和 生物化學法。通常是根據所需標記化合物的組成、結構及應用要求來選擇合適的放射性核素，然后再根據可提供的含有所需放射性核素的原料，結合應用要求來設計其標記路線。原料的物理化學性質不同，所采用的標記路線也不同（見放射性標記方法）。常用于標記的放射
抗原標記蛋白復合體純化實驗
組成型表達FLAG標記 條件性表達FLAG標記 變化起始材料和洗脫條件 用P11離子交換層析柱 ? ? ? ? ? ?
抗原標記蛋白復合體純化實驗
實驗方法原理 首先通過逆轉錄病毒介導的轉基因（用于組成型表達）或四環素調控的系統（用于可誘導表達）建立表達抗原決定簇標記的蛋白復合體亞基的穩定細胞系。然后用抗原決定簇特異的單克隆抗體偶聯的小珠進行免疫親和純化，以沉降抗原決定簇標記的多亞基蛋白復合體。最后在中性 pH 或生理條件下洗脫回收，即可用
3.4－RNA－放射性標記
轉錄過程中的 RNA 分子內標記，轉錄后利用 T4 多核苷酸激酶的 RNA5＇端標記和利用 T4RNA 連接酶的 RNA3＇端標記。實驗材料[α32P]UTP 或 CTP(800Ci ml10mCi ml)UTP 或 CTPT4 多核苷酸激酶(γ32P)ATP牛小腸磷酸酶T4RNA 連接酶[32P]
抗原標記蛋白復合體純化實驗——組成型表達FLAG標記
實驗方法原理首先通過逆轉錄病毒介導的轉基因（用于組成型表達）或四環素調控的系統（用于可誘導表達）建立表達抗原決定簇標記的蛋白復合體亞基的穩定細胞系。然后用抗原決定簇特異的單克隆抗體偶聯的小珠進行免疫親和純化，以沉降抗原決定簇標記的多亞基蛋白復合體。最后在中性 pH 或生理條件下洗脫回收，即可用于功能
抗原標記蛋白復合體純化實驗——條件性表達FLAG標記
實驗方法原理有時導入的 FLAG 標記蛋白編碼序列在逆轉錄病毒介導的轉基因和藥物篩選建立的克隆化細胞系中不表達。這可能是由于外源基因產物沒有被調控的或組成型表達所造成的細胞毒性。為了克服這個問題，基于四環素的使用，一個可誘導的哺乳動物表達系統可以用來“打開”或“關閉” FLAG 標記蛋白的表達。在建
免疫沉淀實驗——免疫沉淀放射性標記抗原
實驗材料蛋白質試劑、試劑盒SDS儀器、耗材離心機實驗步驟1. ?按基本方案進行，但以下說明的操作步驟已經修改：（2b）按所需選用步驟4b所提供的其中之一備擇物（①，②，③）預澄清放射性抗原溶液。（4b）加入1 μl 抗原特異性抗血清，或3 μg 抗原特異性單抗，或抗質特異性雜交瘤培養上 清（克隆化細
蛋白質的生物合成標記實驗
甲硫氨酸短時間標記懸液中的細胞 甲硫氨酸短時間標記貼壁培養細胞 甲硫氨酸對細胞進行脈沖追蹤標記 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 蛋白質
蛋白質的生物合成標記實驗
甲硫氨酸短時間標記懸液中的細胞 甲硫氨酸短時間標記貼壁培養細胞 甲硫氨酸對細胞進行脈沖追蹤標記 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 蛋白質
蛋白質的生物合成標記實驗
實驗材料 蛋白質試劑、試劑盒 甲硫氨酸PBS儀器、耗材 培養箱離心管實驗步驟 1. ?培養懸浮細胞至對數增長期，室溫300 g 離心5 min。回收107~108細胞。?2. ?每2×107細胞用約10 ml 37℃的短時間標記培養基在圓錐型試管中洗滌，于室溫300 g 離心5 min 回收細胞，小
標記抗體的免疫放射技術(IRMA)
（一）原理? IRMA是采用過量的標記抗體與待測抗原的非競爭性結合反應，然后加入固相的抗原吸附劑以結合游離的標記抗體，離心去沉淀，測定上清液中的放射性強度，從而推算出待測樣品的抗原含量。???見表1。表1?? IRMA與RIA的區別IRMARIA標記物質抗體抗原標記物用量過量限量反應方式直接結合競爭
放射免疫分析的標記方法
125I?標記化合物的制備方法可分為直接標記和間接標記兩類方法。(1)直接標記法最常用于肽類、蛋白質和酶的碘化標記,其原理是采用化學或酶促氧化反應直接將125I結合于被標記物分子中酪氨酸殘基或組胺殘基上。其特點是標記方法操作簡便,容易將較多的125I結合到被標記分子上,得到比放射性較高的標記物。但該
標記抗體的免疫放射技術(IRMA)
（一）原理 IRMA是采用過量的標記抗體與待測抗原的非競爭性結合反應，然后加入固相的抗原吸附劑以結合游離的標記抗體，離心去沉淀，測定上清液中的放射性強度，從而推算出待測樣品的抗原含量。 （二）放射免疫檢測與免疫放射檢測(即IRMA與RIA)的區別 見表13－4。 表13－
標記抗體的免疫放射技術(IRMA)
（一）原理??IRMA是采用過量的標記抗體與待測抗原的非競爭性結合反應，然后加入固相的抗原吸附劑以結合游離的標記抗體，離心去沉淀，測定上清液中的放射性強度，從而推算出待測樣品的抗原含量。（二）放射免疫檢測與免疫放射檢測(即IRMA與RIA)的區別見表13－4。表13－4?? IRMA與RIA的區別
非放射性標記探針的雙重標記原位雜交
?? ? 如果用不同的標記物標記不同的核酸探針，只要互相不影響各自的雜交反應，檢測系統也不相互干擾，雜交信號易于分辨，原則上均能用于雙重或多重標記原位雜交。應用非放射性標記探針的雙重標記原位雜交。可克服放射性核素標記探針的分辨率低、時間長以及放射性污染等缺點。??? 1．應用生物素標記探針的雙重標記
蛋白質的生物合成標記實驗（二）
實驗材料細胞試劑、試劑盒PBS甲硫氨酸儀器、耗材培養箱離心機實驗步驟1. ?在100 mm 直徑的培養皿上培養貼壁細胞（0.5~2×107）至70%~90%匯片，吸去培養液，用10 ml 于37℃短時間標記培養基輕輕搖晃冼兩次細胞。2. ?加入5 ml 于37℃短時間標記培養基，在5%CO2的加濕培
重組蛋白質的代謝標記實驗
實驗材料 蛋白質試劑、試劑盒 胎牛血清甲硫氨酸半胱氨酸儀器、耗材 培養瓶離心機轉子實驗步驟 1. ?接種2.5×106細胞于盛有4 ml 含10%胎牛血清的完全培養液的60 mm 肌組織培養皿中。對每一假定重組病毒分別準備一個平皿供感染用，并準備一個對照平皿供野生型桿狀病毒感染。于27℃溫育