用[35S]蛋氨酸和[35S]半胱氨酸標記哺乳動物細胞
酵母和細菌蛋白質的代謝放射標記
| 實驗材料 | 細胞 |
|---|---|
| 儀器、耗材 | 培養基 |
| 實驗步驟 | 1. 制備活躍生長著的細胞。從單層培養細胞（約鋪滿 75%
表面積）中吸去培養基。用預熱至 37℃ 的無血清培養基沖洗兩次（培養基中應該不含蛋氨酸和半胱氨酸）。對于懸浮培養細胞，通過 400 g 離心 5
分鐘收集細胞。用頂熱至 37℃ 的無蛋氨酸培養基重懸沉淀，400 g 離心 5 分鐘。盡可能地去掉上清，用無蛋氨酸培養基重懸細胞至 107 細胞/ml 后轉移至一塊小培養板。 2. 加入預熱的無蛋氨酸和半胱氨酸的培養基，于 37℃ 培養 20 分鐘，以耗盡胞內含硫氨基酸庫。 3. 吸去培養基，立刻換上預熱的、無蛋氨酸和半胱氨酸何含有適量標記氨基酸的新鮮培養基，依據預實驗結果，將細胞于 37℃ 培養一定時間（對于末做過預實驗的蛋白質，以 2~4 小時作為初始值比較合適） 4. 移去放射性培養基。對于單層培養細胞，吸出即可。懸浮培養細胞則可轉至試管，400 g 離心 5 分鐘，倒去上清。 5. 準備一塊凍至 0℃ 的平板（如放在冰盒上的鋁板），將單層細胞培養板放上去。用冰冷的 PBS 沖洗兩次，沖洗液都到進放射性廢料桶。懸浮培養細胞用 PBS 重懸，400 g 離心 5 分鐘，倒去上清。 6. 抽干細胞上殘留的 PBS，裂解細胞。 |
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