蛋白質純化所需的生物提取物制備的實驗（一）
一、化學法和酶法細胞裂解微量的細胞裂解經常通過化學法或酶法或二者共同采用來完成。例如, 超聲和弗式細胞壓碎器 (Frenchpress 均質機) 都不便于用在收集小于或等于 5 mL 的培養液的情況，而且應用這些機械的方法經常會遇到過度的產熱和樣品被氧化等問題。微量細胞裂解的簡化方面的重大進步是以去垢劑為基礎的試劑的發展，如 frPer(Chuetal.，1998) 和 BUgBUSter(GrabSkietaL，1999)。這些試劑的使用不需要昂貴的設備，并且作用非常快速和便于使用。是非常方便有效的髙通量的制備細胞提取物的方法。高活性的酶和酶的混合試劑已經被用來提髙裂解效率和降低提取物的由于消化不完全的基因組 DNA 所導致的高黏度。單獨使用或聯合使用這些商業上可獲得的裂解試劑和酶 (表 18.1) 能夠有效地裂解細菌、酵母、植物、昆蟲和高等真核生物的細胞，并從中提取蛋白質。以去垢劑為基礎的從真核細胞和......閱讀全文
如何采集制備實驗室所需土壤樣品？
一、土壤樣品的采集土壤樣品的采集方法對最終的檢測結果與評價影響很大,采樣時的誤差往往比后續分析的測定誤差大很多。因而,必須嚴格按采樣規范操作,以保證土樣具有代表性,能正確真實地反映原采樣地塊的土壤情況。土樣采集的時間、地點、層次、方法、數量等都需由土樣的分析項目及檢測目的來決定。(1)采樣前的準備工
制備和純化－mRNA－顯示蛋白實驗
實驗方法原理 實驗材料 DNA 庫不含甲硫氨酸的翻譯混合物試劑、試劑盒 MgCl2核苷三磷酸溶液轉錄緩沖液去離子超濾水T7 RNA 聚合酶固體 EDTA尿素緩沖液NaCl乙醇EDTAATPT4 多核苷酸激酶緩沖液T4 多核苷酸激酶T4 DNA 連接酶緩沖液T4 DNA 連接酶乙酸鉀溶液兔網織
制備和純化－mRNA－顯示蛋白實驗
基本方案 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 實驗材料 DNA 庫 不含甲硫氨酸的翻譯混合物
制備和純化－mRNA－顯示蛋白實驗
實驗材料DNA 庫不含甲硫氨酸的翻譯混合物試劑、試劑盒MgCl2核苷三磷酸溶液轉錄緩沖液去離子超濾水T7 RNA 聚合酶固體 EDTA尿素緩沖液NaCl乙醇EDTAATPT4 多核苷酸激酶緩沖液T4 多核苷酸激酶T4 DNA 連接酶緩沖液T4 DNA 連接酶乙酸鉀溶液兔網織紅細胞裂解物翻譯試劑盒氯化
細胞和亞細胞提取物的制備實驗3
方案3 用于免疫印跡的動物培養細胞、酵母和細菌的裂解實驗實驗方法原理去垢劑裂解細胞法通常用于培養的動物細胞。典型的離子型去垢劑SDS(如2%SDS)能充分地裂解細胞。培養的動物細胞和細菌，如可以使用這種方式裂解。假如實驗所用的抗體識別的抗原決定簇取決于自然空間構象，并對還原環境敏感，那么在裂解緩沖液
細胞和亞細胞提取物的制備實驗6
方案6 細菌中重組蛋白的大量提取實驗實驗方法原理利用細菌獲得用于純化的重組蛋白是非常方便的。適用于細菌細胞蛋白提取的方法包括超聲波處理、玻璃珠研磨、釩土或石英砂研磨、French 加壓罐高壓剪切細胞和溶’菌酶處理。這些方法適用于從各種革蘭陰性菌和革蘭陽性菌中制備蛋白提取物。通常是使用酶的方法破壞細胞
細胞和亞細胞提取物的制備實驗7
方案7 從包含體中溶解大腸桿菌重組蛋白實驗實驗方法原理由于分子克隆技術能夠使細菌高水平表達蛋白，因此原核表達是一個非常便利的獲得重組蛋白的系統。遺憾的是這些蛋白在細菌中易于聚合和沉淀，形成難溶解的包含體，因而很難純化。非細菌蛋白的包含體尤其普遍。雖然沒有一種可用于所有蛋白的普適方法，還是有許多策略適
細胞和亞細胞提取物的制備實驗8
方案8 酵母提取物的制備實驗實驗方法原理由于酵母的經典遺傳分析和分子遺傳分析都已經研究得非常透徹，因而對于純化重組動物蛋白來說，酵母是一個很有吸引力的表達體系。關于培養和收集酵母細胞的討論，尤其是芽殖酵母，參見 Jazwinski(1990)。酵母細胞的裂解方法有很多種，包括自溶、壓力破碎（如 Fr
細胞和亞細胞提取物的制備實驗5
方案5 細菌中重組蛋白的小量提取實驗實驗方法原理利用細菌獲得用于純化的重組蛋白是非常方便的。為了檢測誘導和重組蛋白的表達水平，評估方法的快速簡單是很重要的。本方案使用 0.5% TritonX-1OO 裂解細胞，小量制備細菌提取物。實驗材料表達目標重組蛋白的細菌細胞試劑、試劑盒二硫蘇糖醇（DTT)樣
細胞和亞細胞提取物的制備實驗2
方案2 用于免疫沉淀的培養細胞的裂解實驗實驗方法原理培養的動物細胞一般使用溫和去垢劑來裂解。如果低濃度的去垢劑就能引起細胞的充分裂解（如 l%NP-40 或 l%Triton X-100)，那么這對目標蛋白的影響可能比方案 1 中所討論的勻漿方法更溫和。去垢劑的選擇必須根據免疫沉淀所用的抗體的識別表
細胞和亞細胞提取物的制備實驗4
方案4 氮艙減壓法裂解培養細胞實驗實驗方法原理通過來自增壓艙中的氮氣減壓膨脹來破碎細胞是一種快速、有效的細胞和組織的勻漿方法，能釋放完整的細胞器和制備細胞膜（Hunter and Commerford，1961)。該方法的原理很簡單：細胞放在一個壓力艙中，在高壓下（約5500kPa，相當于800ps
細胞和亞細胞提取物的制備實驗9
實驗方法原理差異去垢劑分離法（differential detergent fractionation, DDF) 包括使用一系列含不同去垢劑的 PIPES 緩沖液對細胞進行連續抽提，首先是毛地黃皂苷，其次是 Triton, 最后是 Tween/脫氧膽酸鹽。這些步驟產生 4 種在生化和電泳上相異的組
蛋白質的純化實驗——膠體過濾法
不同大小的蛋白質分子進入膠體過濾管柱，可依其分子量差異分離；是一種廣泛應用的蛋白質partition色析法 。實驗材料Sephacryl S-300膠體試劑、試劑盒緩沖液buffer A-150儀器、耗材色析管柱鐵夾試管鐵架水平儀收集器濃縮用離心機?濃縮用離心管實驗步驟一、儀器設備色析管柱 （Pha
蛋白質的表達、分離、純化實驗——層析法
蛋白質表達、分離、純化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表達調控的機理；（2）供作結構與功能的研究；（3）作為催化劑、營養劑等。實驗方法原理攜帶有目標蛋白基因的質粒在大腸桿菌BL21中，在 37℃，IPTG誘導下，超量表達攜帶有6個連續組氨酸殘基的重組氯霉素酰基轉移酶蛋白，該蛋白可用一種通過共
細菌細胞的制備實驗實驗——多核糖體的純化
實驗材料真細菌多核糖體植物多核糖體試劑、試劑盒多核糖體蔗糖梯度緩沖液蔗糖梯度緩沖液實驗步驟一、真細菌多核糖體1. 含有多核糖體（每管 0.6 ml ) 的上清鋪到 15%~30% 蔗糖梯度的上面，在該蔗糖梯度的下面為 0.5 ml 的 60% 蔗糖鋪墊液，內含如下緩沖液：多核糖體蔗糖梯度緩沖液：20
蛋白質分離純化的一般程序
蛋白質分離純化的一般程序可分為以下幾個步驟：（一）材料的預處理及細胞破碎分離提純某一種蛋白質時，首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來并保持原來的天然狀態，不喪失活性。所以要采用適當的方法將組織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有：1.機械破碎法這種方法是利用機械力的剪切作用，使細胞破碎。常用設備有
蛋白質分離純化的一般程序
1、材料的預處理及細胞破碎 分離提純某一種蛋白質時，首先要把蛋白質從組織或細胞中稀釋出來并保持原來的天然狀態，不喪失活性。所以要采用適當的方法將組織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有： 1.1、機械破碎法 這種方法是利用機械力的剪切作用，使細胞破碎。常用設備有，高速組織搗碎機、勻漿器、
mRNA的分離和純化實驗（一）
實驗原理從細胞或組織中得到RNA是一種混合物，其中包括tRNA，rRNA和mRNA，其中RNA為75％～ 85％，tRNA占10％～16％，而mRNA僅占1%～5％，并且mRNA基因序列不同，分子量大小不均一，各基因的表達豐度也不一樣。每克細胞可分離出5-10mg RNA。真核生物mRNA具
微生物的分離和純化實驗
在土壤、水、空氣或人及動、植物體中，不同種類的微生物絕大多數都是混雜生活在一起，（1）用于細胞分離（2）細胞純化（3）細胞增殖培養。實驗方法原理為了獲得某種微生物的純培養，一般是根據該微生物對營養、酸堿度、氧等條件要求不同，而供給它適宜的培養條件，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長，而抑制其他菌生長
微生物的分離和純化實驗
實驗方法原理?為了獲得某種微生物的純培養，一般是根據該微生物對營養、酸堿度、氧等條件要求不同，而供給它適宜的培養條件，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長，而抑制其他菌生長的環境，從而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法或平板劃線分離法等分離、純化該微生物，直至得到純菌株。土
蛋白質的純化
蛋白質的分離純化方法很多，主要有：（一）根據蛋白質溶解度不同的分離方法1、蛋白質的鹽析 中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子
蛋白質的純化
實驗概要本實驗介紹了用蛋白純化試劑盒(HisTrap HP Kit)進行蛋白質純化的過程。主要試劑高分子量蛋白Marker購自上海華舜生物工程有限公司蛋白純化所用的試劑盒(HisTrap HP Kit)購自Amersham Biosciences ( USA)公司0.45 pm濾膜，磷酸緩沖液，咪唑
蛋白質提取與純化技術（一）
以蛋白質和結構與功能為基礎，從分子水平上認識生命現象，已經成為現代生物學發展的主要方向，研究蛋白質，首先要得到高度純化并具有生物活性的目的物質。蛋白質的制備工作涉及物理、化學和生物等各方面知識，但基本原理不外乎兩方面。一是得用混合物中幾個組分分配率的差別，把它們分配到可用機械方法分離的兩個或幾個物相
蛋白質提取與純化技術（一）
選擇材料及預處理以蛋白質和結構與功能為基礎，從分子水平上認識生命現象，已經成為現代生物學發展的主要方向，研究蛋白質，首先要得到高度純化并具有生物活性的目的物質。蛋白質的制備工作涉及物理、化學和生物等各方面知識，但基本原理不外乎兩方面。一是得用混合物中幾個組分分配率的差別，把它們分配到可用機械方法分離
半制備規模單鏈RNA純化（一）
Sean M. McCarthy and Martin GilarWaters Corporation, Milford, MA, U.S.引言寡核苷酸合成是非常高效和高產率的過程。在固相載體上進行寡核苷酸反應的典型產率為每耦合階98～99.5%。在典型的多階寡核苷酸合成中，雜質聚集在一起，即使是一
微生物分離純化實驗
實驗方法原理 該方法操作簡便，普通用于微生物的分離與純化。其基本原理包括兩方面：1. 選擇適合于待分離微生物的生長條件，如營養、酸堿度、濕度和氧等要求或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其他微生物生長的環境，從面淘汰一些不需要的微生物。2. 微生物在固體培養基上生長形成的單個菌落可以是由一
細菌細胞的制備實驗實驗——70S核糖體的純化
實驗材料核糖體試劑、試劑盒致密偶聯緩沖液儀器、耗材Beckman Vti50 轉頭實驗步驟1. 采用 Beckman Vti50 轉頭和 7% 至 30% (w/v) 的線性蔗糖梯度沉降來純化 70S 真細菌的核糖體。這一步可以確保大的蛋白質聚集物不會與 70S 核糖體一起沉淀下來。并可以產生致密偶
實驗室常用微生物菌種的分離和純化方法（一）
從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。在分子生物學的研究及應用中，不僅需要通過分離純化技術從混雜的天然微生物群中分離出特定的微生物，而且還必須隨時注意保持微生物純培養物的“純潔”，防止其他微生物的混入。?1、用固體培養基分離和純化?單個微生物在適宜的固體培養基表
濾膠過濾層析法蛋白質的純化實驗
實驗方法原理 凝膠過濾層析是根據蛋白質分子大小不同而達到分離效果的，凝膠過濾填料中含有大量微孔，只允許緩沖液及小分子量蛋白質通過，而大分子蛋白質及一些蛋白復合物則被阻擋在外。因此，高分子量的蛋白質在填料顆粒間隙中流動，比低分于量蛋白更早地被洗脫下來。最大的蛋白質分子最早流出柱子，因為它們在到達柱底前
濾膠過濾層析法蛋白質的純化實驗
凝膠過濾層析法 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 凝膠過濾層析是根據蛋白質分子大小不同而達到分離效果的，凝膠過濾填料中含有大量微孔，只允許緩沖液及小分子量蛋白質通過，而大分子蛋白