細胞和亞細胞提取物的制備實驗2

培養的動物細胞一般使用溫和去垢劑來裂解。如果低濃度的去垢劑就能引起細胞的充分裂解（如 l%NP-40 或 l%Triton X-100)，那么這對目標蛋白的影響可能比方案 1 中所討論的勻漿方法更溫和。去垢劑的選擇必須根據免疫沉淀所用的抗體的識別表位的性質來決定。假如抗體識別線性抗原表位（如合成肽），那么可以使用強變性裂解緩沖液（如 RIPA 緩沖液）。另一方面，假如抗體識別有構象的表位，則應使用 NP-40 裂解緩沖液（或 1%TritonX-100)(裂解緩沖液細節見表 3.5)。

本方案由 Hong Ji(Joint Protomics Laboratory of the Ludwig Institute for Cancer Research,and Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research，Melbourne，Australia) 提供。

單層培養或懸浮培養的細胞

裂解緩沖液磷酸鹽緩沖液

離心機

一、方法 A: 單層培養的細胞的裂解

1.去掉培養基，并用冷 PBS 洗細胞 2 次。

2.把培養瓶置于冰上。

3.100mm 的培養瓶（預冷至 4°C) 中加入 10ml 裂解緩沖液，裂解緩沖液的體積應根據培養瓶的大小來調整。

4.冰上孵育細胞 10~30 min(取決于所孵育的細胞系），并不時地搖動瓶子。

5.在冰上傾斜瓶子，使緩沖液流向一 邊，用吸管將裂解液轉移到一’個微量離心管或其他合適的離心管中。其他培養瓶均如此操作。

有些研究者喜歡把細胞從培養瓶中刮下來，但這可能產生細胞張力，只在特殊情況下使用。

6.4°C 條件下 20000g離心裂解液 10min。

7.小心地把上清移到另一個試管中，應確保不要碰到沉淀物。將裂解液放置于冰上，以備免疫沉淀所用（見 Harlow and Lane，1999） 細胞裂解液可以使用干冰和乙醇的混合物迅速冰凍，一70°C 條件下可以長期儲存。但是，通過免疫沉淀分離的蛋白復合物的分析，建議使用新制備的細胞裂解液。

二、方法 B: 懸浮生長的細胞的裂解

1.細胞在 480 g的離心力條件下離心 10 min，棄去上清。

2.用冷 PBS 洗細胞兩次，然后將洗過的細胞置于冰上。

3.重新懸浮沉淀，使 1.0 ml 裂解液（冷卻到 4°C) 中含大約 1X10⁷~5X10⁷ 個細胞。

4.冰上孵育細胞 15 min，并不時地振動小管。

5.4°C 條件下 20000 g 離心裂解液 10 min。

6.小心地把上清移到另一個小管中，應確保不要碰到沉淀物。將裂解液置于冰上，以備免疫沉淀所用（見 Harlow and Lane，1999)。

細胞裂解液可以使用干冰和乙醇的混合物迅速冰凍，-70°C 條件下可以長期儲存。但是，通過免疫沉淀分離的蛋白復合物的分析，建議使用新制備的細胞裂解液。