用放射性標記的寡核苷酸雜交篩選定點誘變重組克隆實驗
實驗方法原理 試劑、試劑盒 甲酸銨 寡核苷酸雜交溶液 寡核苷酸預雜交液 TE 噬菌體T4多核苷酸激酶 限制性內切核酸酶 瓊脂糖凝膠 誘變寡核苷酸 [γ-32P]ATP 2XYT 頂層瓊脂和 2xYT 瓊脂平皿 儀器、耗材 鈍端鑷子 皮下注射用針頭（18 號）和印度墨水 孵箱 硝酸纖維素膜或尼龍膜 真空烤箱 ......閱讀全文
用放射性標記的寡核苷酸雜交篩選定點誘變重組克隆實驗
實驗方法原理 試劑、試劑盒 甲酸銨寡核苷酸雜交溶液寡核苷酸預雜交液TE噬菌體T4多核苷酸激酶限制性內切核酸酶瓊脂糖凝膠誘變寡核苷酸[γ-32P]ATP2XYT 頂層瓊脂和 2xYT 瓊脂平皿 儀器、耗材 鈍端鑷子皮下注射用針頭（18 號）和印度墨水孵箱硝酸纖維素膜或尼龍膜真空烤箱68°C 水
用放射性標記的寡核苷酸雜交篩選定點誘變重組克隆實驗
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 試劑、試劑盒 甲酸銨 寡核苷酸雜交溶液 寡核苷酸預雜交液 TE 噬菌體T4多核
用放射性標記的寡核苷酸雜交篩選定點誘變重組克隆實驗
本方案主要描述了篩選噬菌體 M13 重組克隆，而一種選擇方案是篩選含噬菌粒的細菌克隆。最后也介紹了用 PCR 檢測突變體的方法。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。實驗方法原理試劑、試劑盒甲酸銨寡核苷酸雜交溶液寡核苷酸預雜交液TE噬菌體T4多核
雜交瘤細胞的篩選
雜交瘤細胞的篩選??在細胞融合后，要從上述五種細胞中篩選出雜交瘤細胞，一般使用HAT培養進行篩選，HAT培養基中含有次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶（T）三種成分。細胞的DNA合成有內源性途徑（主要途徑）和外源性途徑（旁路途徑）兩種方式。內源性途徑就是利用谷氨酰胺或單磷酸尿苷酸在二氫葉酸還原
非放射性標記探針的雙重標記原位雜交
?? ? 如果用不同的標記物標記不同的核酸探針，只要互相不影響各自的雜交反應，檢測系統也不相互干擾，雜交信號易于分辨，原則上均能用于雙重或多重標記原位雜交。應用非放射性標記探針的雙重標記原位雜交。可克服放射性核素標記探針的分辨率低、時間長以及放射性污染等缺點。??? 1．應用生物素標記探針的雙重標記
大量細菌克隆的雜交方法篩選實驗
這一方法由 Hanahan 和 Meselson (1980, 1983)報道，主要用來處理由質粒 cDNA 文庫轉化的細菌。將轉化菌的混合物或者一份擴增的 cDNA 文庫直接置于不含洗滌劑的硝酸纖維素膜或尼龍膜上，復制膜用膜-膜接觸的方法制備。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。實驗方
小量細菌克隆的雜交法篩選實驗
實驗方法原理 主瓊脂板上和覆蓋于另一塊瓊脂板表面的硝酸纖維濾膜或尼龍膜上的細菌克隆可以被定位， 經過一段時間，已經在濾膜上生長的克隆可以被原位裂解以備雜交之用。同時，主瓊脂板可置于 4℃ 保存，直到篩選的結果出來為止。實驗材料 E.coli試劑、試劑盒 LB 或 SOB 瓊脂板儀器、耗材 硝酸纖維素
小量細菌克隆的雜交法篩選實驗
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 主瓊脂板上和覆蓋于另一塊瓊脂板表面的硝酸纖維濾膜或尼龍膜上的細菌克隆可以被定位， 經過一段時間，已經在濾膜上生長的克隆可以被原位裂解以備雜交之用。同時，主瓊脂板可置于 4℃ 保存，直到篩選的結果出來為止。
大量細菌克隆的雜交方法篩選實驗
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 這一方法由 Hanahan 和 Meselson (1980, 1983)報道，主要用來處理由質粒 cDNA 文庫轉化的細菌。將轉化菌的混合物或者一份擴增的 cDNA 文庫直接置于不含洗滌劑的硝酸纖維素膜或尼龍膜上，復制
大量細菌克隆的雜交方法篩選實驗
實驗方法原理 這一方法由 Hanahan 和 Meselson (1980, 1983)報道，主要用來處理由質粒 cDNA 文庫轉化的細菌。將轉化菌的混合物或者一份擴增的 cDNA 文庫直接置于不含洗滌劑的硝酸纖維素膜或尼龍膜上，復制膜用膜-膜接觸的方法制備。采用這一方法，每塊 150
雜交瘤細胞怎么篩選分離方法
第一次用加入氨基蝶呤的選擇培養基選擇出融合正確的雜交瘤細胞第二次用抗原抗體反應選擇出可以產生抗體的雜交瘤細胞。
定點誘變實驗
實驗材料 DNA試劑、試劑盒 TE寡核苷酸引物質粒dNTPDNA聚合酶氯仿石蠟油無水乙醇儀器、耗材 離心管熱循環儀離心機實驗步驟 1. ?利用突變區兩側的限制性內切酶位點將待誘變的DNA片段亞克隆進高拷貝數的載體中。?2. ?用小量制備的質粒提取模板DNA，用TE緩沖液重懸100 ng DNA至終濃
定點誘變實驗
基本方案 利用PCR引物點突變 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 DNA 試劑、試劑盒
中等量細胞克隆的雜交法篩選實驗
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 這一方法適用于任何大小的細菌克隆，但小的克隆可以給出最清楚的結果。小克隆可以產生尖銳的雜交信號，而且在克隆從瓊脂板轉到膜的過程中不會彌散。操作中 采用能夠包含 2500 克隆的 90 mm 板效果最好。在保證
中等量細胞克隆的雜交法篩選實驗
實驗方法原理 這一方法適用于任何大小的細菌克隆，但小的克隆可以給出最清楚的結果。小克隆可以產生尖銳的雜交信號，而且在克隆從瓊脂板轉到膜的過程中不會彌散。操作中 采用能夠包含 2500 克隆的 90 mm 板效果最好。在保證沒有氣泡的情況下，用更大的濾膜很難正好覆蓋于 150 mm 板。實驗材料
小量細菌克隆的雜交法篩選實驗步驟
小量細菌克隆的雜交法篩選實驗步驟，一、材料1. 培養基含有適當抗菌素的 LB 或 SOB 瓊脂板。含有氯霉素的 LB 或 SOB 瓊脂板。2. 專用設備(1) 硝酸纖維素膜（Millipore HAWP，或類似產品）或尼龍膜。濾膜不必是無去污劑污染或無菌。(2) 注射器（3cc )，針頭（18 號）
中等量細胞克隆的雜交法篩選實驗
這一方法適用于任何大小的細菌克隆，但小的克隆可以給出最清楚的結果。小克隆可以產生尖銳的雜交信號，而且在克隆從瓊脂板轉到膜的過程中不會彌散。操作中采用能夠包含 2500 克隆的 90 mm 板效果最好。在保證沒有氣泡的情況下，用更大的濾膜很難正好覆蓋于 150 mm 板。本實驗來源「分子克隆實驗指南第
定點誘變(DpnI法)
1、引物設計：每條引物都要攜帶有所需的突變位點，引物一般長25~45bp,設計的突變位點需位于引物中部。2、反應：使用高保真的pyrobest DNA聚合酶 ;循環次數少，一般為12個循環。反應體系：10x pyrobest Buffer ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 5 uldN
定點誘變(DpnI法)
1、引物設計：每條引物都要攜帶有所需的突變位點，引物一般長25~45bp,設計的突變位點需位于引物中部。2、反應：使用高保真的pyrobest DNA聚合酶 ;循環次數少，一般為12個循環。反應體系：10x pyrobest Buffer 5 uldNTP Mixture(10mM) 1ul模板DN
放射性標記的探針與固定在膜上的核酸Southern雜交
放射性標記的探針與固定在膜上的核酸Southern雜交1.?將含有靶DNA的膜漂浮在盛有6×SSC（或6×SSPE）的皿中直到膜自下面而上完全浸濕。將膜浸于溶液中2 min。2.?用下列方法之一進行預雜交在熱密封的袋中進行的雜交a.???????將膜塞入熱密封袋中（如Sears Seal-A-Mea
放射性標記探針與核酸雜交反應的步一般過程
1、配制所需試劑SSC 溶液(20×):3mol/L NaCl,0.3mol/L 檸檬酸鈉。Denhardt’s溶液(50×):聚蔗糖5g,聚乙烯吡咯烷酮5g,牛血清白蛋白(BSA)5g,加水至500mL。預雜交液:6×SSC,5×Denhardt’s溶液,0.5%SDS,100μg/mL 經變性或
雜交瘤和噬菌體展示篩選方法開發
Part 1前言ELISA方法用于雜交瘤和噬菌體展示篩選是為廣泛的高通量的抗體發現的篩選方法，其實質是親和力測定方法的一種變種，其目的是需要建立ELISA信號值和樣品親和力大小之間的正相關性。相對于采用ELISA進行抗體的親和力測定方法，用于雜交瘤和噬菌體展示篩選的ELISA方法有以下難點，1.待測
雜交瘤細胞系的產生與篩選
脾B細胞+骨髓瘤細胞，加聚乙二醇（PEG）促進細胞融合，HAT培養基中培養（內含次黃嘌呤、氨基蝶呤、T）生長出來的脾B-骨髓瘤融合細胞繼續擴大培養。細胞融合物中包含：脾-脾融合細胞：不能生長，脾細胞不能體外培養。骨-骨融合細胞：不能利用次黃嘌呤，但可通過第二途 徑利用葉酸還原酶合成嘌呤。氨基蝶呤對葉
放射性標記的探針與固定在膜上的核酸的Southern雜交
實驗方法原理 Southern 雜交獲得的信號強度取決于若干因素，包括固定的 DNA 與探針互補的比例、探針的大小及特異活性以及轉移到膜上的基因組 DNA 的數量。在最佳條件下，這種方法的敏感度足以檢測到與 32P 標記的高度特異（>109 cpm/μg）的探針互補的
放射性標記的探針與固定在膜上的核酸的Southern雜交
Southern 雜交獲得的信號強度取決于若干因素，包括固定的 DNA 與探針互補的比例、探針的大小及特異活性以及轉移到膜上的基因組 DNA 的數量。在最佳條件下，這種方法的敏感度足以檢測到與?32P 標記的高度特異（>109?cpm/μg）的探針互補的109?cpm/μg）的探針互補的
放射性標記的探針與固定在膜上的核酸的Southern雜交
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 Southern 雜交獲得的信號強度取決于若干因素，包括固定的 DNA 與探針互補的比例、探針的大小及特異活性以及轉移到膜上的基因組 DNA 的數量。在最佳條件下，這種方法的敏感度足以檢測到與 32P 標記的高度特異（>109
通過雜交篩選未擴增的黏粒文庫（濾膜影印）
實驗方法原理 經黏粒轉化的稠密細菌菌落可通過雜交的方法篩選，該方法源于質粒轉化菌落的大規模篩選（Hanahan and Meselon 1980)。實驗步驟 一、材料1. 培養基含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 瓊脂平板（150 mm )TB 培養基2. 專用設備厚玻璃板皮下注射針頭（17號）
通過雜交篩選未擴增的黏粒文庫（濾膜影印）
經黏粒轉化的稠密細菌菌落可通過雜交的方法篩選，該方法源于質粒轉化菌落的大規模篩選（Hanahan and Meselon 1980)。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。實驗方法原理經黏粒轉化的稠密細菌菌落可通過雜交的方法篩選，該方法源于質粒轉化菌落的大規模篩選（Hanahan and
用雜交的方法篩選大片段插入的文庫實驗
實驗步驟由于原代的轉化子只能產生數目有限的濾膜，因而隨機鋪板不適合濾膜的制備以及 YAC、BAC 和 PAC 文庫的保存，而且由于克隆增殖率存在差別，因而無論是哪一種擴增形式都會將偏差帶人文庫中去。因此，原代的轉化子應加入微孔板中，放置于-8℃ 保存。這使得制造分配用的文庫拷貝變得簡單易行，而且使組
通過雜交篩選未擴增的黏粒文庫（濾膜影印）
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 經黏粒轉化的稠密細菌菌落可通過雜交的方法篩選，該方法源于質粒轉化菌落的大規模篩選（Hanahan and Meselon 1980)。 實驗步驟