定點誘變實驗

DNA

TE 寡核苷酸引物 質粒 dNTP DNA聚合酶 氯仿 石蠟油 無水乙醇

離心管 熱循環儀 離心機

1.  利用突變區兩側的限制性內切酶位點將待誘變的DNA片段亞克隆進高拷貝數的載體中。

2.  用小量制備的質粒提取模板DNA，用TE緩沖液重懸100 ng DNA至終濃為1 ng/μl。

3.  合成寡核苷酸引物，以變性聚丙烯酰胺凝膠電泳法進行純化，重懸于500 μl TE緩沖液中，在A₂₆₀吸光度，調整濃度至500 ng/μl。
 

4.  往兩個500 μl 量離心管加入下列試劑，其中一管加寡核苷酸1，另一管加寡核苷酸2：

10 μl  10×擴增反應緩沖液
10 μl  2 mmol/l 4種dNTP

1 μl  寡核苷酸1或2
1 μl  適當的M13側翼序列引物，正向或反向
加水至99.5 μl
0.5 μl  Taq DNA聚合酶
用100 μl 石蠟油覆蓋上述反應液

5.  按下列條件在自動熱循環儀上擴增20~5個循環：
45 s  93℃（變性）
2 min  50℃（雜交）
2 min  70℃（延伸）

最后一個循環結束后，在72℃保溫10min。
 

6.  取4 μl進行非變性瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，以驗證擴增反應已產生了預期的 產物。

7.  吸去石蠟油，并用氯仿抽提1次以去掉剩余的石蠟油，酚抽提和乙醇沉淀。

8.  取擴增所得的DNA片段的一半量用側翼的和所引入的限制性內切酶切割，用低熔點瓊脂糖電泳純化、酶切片段。

9.  經連接反應將兩條片段亞克隆進合適的已經相應的內切酶消化后的載體，以獲得含引入限制性酶切點的DNA片段的重組質粒。

10.  將質粒轉化入大腸桿菌，小置制備質粒DNA。

11.  通過DNA測序分析擴增的片段部分，以證實突變已經引入。