| 實驗步驟 |
材料
緩沖液和溶液
各種貯存液，緩沖液的成分及相關試劑請參見附錄1
將貯存液稀釋至所需的濃度。
甲酸銨（0.2mol/L)
寡核苷酸雜交溶液
6XSSC
5XDenhardt's溶液
106至107dpm/ml放射性標記的寡核苷酸
寡核苷酸預雜交液
6xSSC
5xDenhardt's溶液
0.1%(m/V)SDS
6XSSC
6XSSC應在所需要的溫度下頇熱，請見步驟 11，12和 13。
TE(pH7.6)
酶和緩沖液
噬菌體T4多核苷酸激酶
限制性內切核酸酶
請見步驟 18 和 19。
凝膠
瓊脂糖凝膠
請見步驟 18。
核酸和寡梭苷酸
誘變寡核苷酸（10pmoles/ul)
放射性物質
[γ-32P]ATP(>5000Ci/mmole,10mCi/ml)
培養基
2XYT 頂層瓊脂和 2xYT 瓊脂平皿
專用設備
鈍端鑷子（例如，Millipore 鑷子）
皮下注射用針頭（18 號）和印度墨水（選做）
預雜交用 65°C 孵箱。
適合于雜交溫度的孵箱，請見步驟 7 注釋。
硝酸纖維素膜或尼龍膜。
真空烤箱
68°C 水浴
Whatman DEAE 濾紙（DE81)
濾紙貯存在室溫，操作時帶手套。
其他試劑
本方案步驟 4 需要的試劑列在第 10 章方案 4 中。
本方案步驟14 需要的試劑列在第 3 章方案 4 中。
本方案步驟15 和16 需要的試劑列在第 2 章方案 3,4 或 5 中。
本方案步驟17 需要的試劑列在第 3 章方案 3 中。
本方案步驟 20 需要的試劑列在第 6 章方窠 8和10 中。
載體和細菌菌株
誘變的噬菌體 M13 重組體
請使用方案 2 中產生的含噬菌體 M13 噬菌斑的培養皿。
未經誘變的噬菌體 M13 重組體
用做為陰性對照；請參見步驟 5。
大腸桿菌 TG1 或相應的菌株
方法
用磷酸化反應進行寡核苷酸的放射性標記
1. 在滅菌的微量離心管中混合以下試劑：
誘變寡核苷酸（10pmoles/ul) 1ul
10x 噬菌體 T4 多核苷酸激酶緩沖液 1ul
10mCi/ml[γ-32P]ATP(10~50pmoles) 1ul
水 6ul
5~10 單位/ul 噬菌體多梭苷酸激酶 1ul
混合物于 37°C 孵育 30 min。
2. 加入 90ulTE(pH7.6), 將混合物稀釋至 100ul，68°C 加熱 10 min 滅活多核苷酸激酶。
3. 測量 32P 轉移到寡核苷酸上的效率，按以下過程操作，經 DE81 濾紙層析估計比活。
a. 剪下一條約 1cm 寬，7~10 cm 長的 DE81 濾紙，用軟芯鉛筆在距離一端 1.5 cm 處劃一條平行的細線。標記層析開始的原點。
b.
在原點處點 1.0ul 稀釋的磷酸化反應物。在 250 ml 燒杯中加入約 25~50 ml 的 0.2 ml/L 甲酸銨，使其深度達 0.5
cm 左右。將 DE81
濾紙條垂直放在燒杯中，使位于原點的放射性樣品剛好在緩沖液上方。用一塊玻璃板或鋁箔蓋住燒杯，使層析逐漸進展直至溶劑遷移的前端接近燒杯頂端。
c. 用莎倫包裝膜包裹 DE81 濾紙條，用很短的時間進行放射自顯影。以顯影的 X 射線膠片為基準，切下溶劑前端帶放射性的區域、原點區域和含放射性的其他區域。用液閃計數器測定每一部分的放射性同位素強度。
寡核苷酸保留在原點，而 ATP 和無機磷與溶劑遷移的方向相同。無機碘遷移稍落后于溶劑前沿，而 ATP 位于原點和無機磷之間的同等距離將來自 [γ-32P]ATP 的磷酸轉移至寡核苷酸上導致原點出現放射性物質，由寡核苷酸摩爾數計箅出放射性標記探針的比活以及 [γ-32P]ATP 在反應中的比活和將放射性轉移至寡核苷酸上的效率。步驟 1 中大于反應混合物 50% 的放射活性應被轉移到寡核苷酸上。
4.(可做可不做）按第 10 章方案 4 介紹的過程，用十六烷基溴化吡啶鎓從寡核苷酸中沉淀掉未被結合的放射性物質。
正常情況下，反應混合物可直接用做探針。除非雜交背景持續引起麻煩時，一般不需要進行該步驟。
噬菌體 M13 噬菌斑的篩選
5. 按以下步驟制備用于放射性標記的寡核苷酸探針篩選的噬菌體 M13 噬菌斑的復制物：
a. 把含 100~500 個噬菌斑的培養皿置于 4°C 至少 30 min。至少應包括個含原始野生型重組 M13 噬菌斑的培養皿。該培養皿做為雜交和洗膜步驟中的陰性對照。
b. 當培養皿完全冷透后，從冷室中取出平皿，馬上將作為標記的干的硝酸纖維素膜或尼龍膜覆蓋于每個平皿的瓊脂表面。用一個 18 號針頭穿過濾膜和下層瓊脂制作一系列洞。這些洞將在后來的步驟中用作濾膜與下層瓊脂匹配的標志物。
在針刺濾膜前用針頭沾取少量印度墨水可制作成一種擦不掉的標志點。
c.30s 至 4 min 后，用鈍端鑷子仔細的從培養皿上揭下每一張濾膜。將沾有噬菌斑的濾膜面向上平鋪在一疊吸水紙上。用莎倫包裝膜包裹培養皿，貯存在 4°C 直到需要。
d. 當濾膜干燥時（室溫下大約 30 min)，放在真空千燥箱中 80°C 烘烤 1h。
由于單鏈 DNA 可在烘烤過程中從噬菌體中釋放出來，因此在篩選噬菌體 M13 噬菌斑時不需要用堿對 DNA 進行變性處理。
6.
將所有的濾膜轉移至一個可加熱封口的塑料袋（例如 Sear seal-A-Meal)
中，或一個直徑合適的蒸發皿中，或雜交用滾筒中。加入寡核苷酸預雜交液（在塑料袋或蒸發皿中操作時，82 mmol/L 濾膜加入約 10 ml
預雜交液；在雜交滾筒中操作時，82 mmol/L 濾膜加入約 5 ml 預雜交液)。封上袋口，用莎倫包裝膜蓋住蒸發皿口或蓋上雜交滾筒蓋，65°C
孵育 l~2 h。
7. 棄去預雜交液，放入含寡核苷酸探針的雜交液（約 5 ml/82 mmol/L 濾膜)。重新封上袋口，或覆蓋蒸發皿，或蓋上雜交滾筒。在合適的溫度下進行雜交反應 4~6 h。
雜交反應應在低于放射性標記的寡核苷酸 Tm 值 5~10°C 的溫度下進行。寡核苷酸的 Tm 值計算公式如下：
Tm=4(G+C)+（A+T)
G+C 是寡核苷酸中 G、C 殘基的總數，而 A+T 寡核苷酸中 A、T 殘基的總數。
8.
雜交結束后，將濾膜快速轉移到含 200~300 ml 的 6XSSC 溶液的盤中。用莎倫包裝膜覆蓋盤子，室溫下在旋轉搖床中振蕩 15 min,
每隔 5 min 更換洗液。同時將剩余的放射性雜交液從袋子，蒸發皿或滾筒中轉移到一個一次性塑料管中. 蓋緊瓶口，將放射性溶液貯存在-20°C,
直至重新用于陽性噬菌斑篩選（步驟 13)。
恰當地標記和貯存雜交液。
9.
洗膜結束后，將雜交濾膜快速轉移到一張平鋪在工作臺上的莎倫包裝膜膜上。用另外一張莎倫包裝膜膜覆蓋濾膜。將兩張莎倫包裝膜膜的邊緣折疊封口。把帶有放射性物質或熒光墨水的點貼在包裹外面。在使用增感屏的情況下，通常雜交濾膜暴光
X 射線膠片的放射自顯影過程需要 1~2 h。
要點：不要使莎倫包裝膜上的濾膜干燥。
10. 將雜交濾膜圖案與培養皿的噬菌斑分布進行比較，在該步驟中，發現所有的噬菌斑都能與探針雜交是正常的。但某些噬菌斑比另外一些噬菌斑顯示出更強的雜交信號，這些噬菌斑通常攜帶突變體。
11. 將濾膜轉移到一個預熱到溫度比 Tm 值低 10°C 的含 100~200 ml 6XSSC 的塑料盒
中。振蕩 2 min(請見下面的注釋)，然后按步驟 9 描述的方法將濾膜轉移到一張莎倫包裝膜上，進行再次放射自顯影。這一步往往能鑒定出兩種類型的噬菌斑，一種放射性信號強度降低，另一種不發生變化。
如果使用短的（<20bP)
的寡核苷酸探針，不要在低于 Tm 值 10°C
以下的溫度中洗膜超過兩分鐘。否則的話，放射性寡核苷酸和誘變靶序列間形成的完好的雜交體將解離。長的寡核苷酸探針需要根據經驗摸索出的較長的洗膜時間。可用手提式微型放射探測儀監測洗膜過程中放射性信號強度，根據放射性信號強度降低悄況估計出合適的洗膜條件。
12. 重復進行洗膜和放射自顯影，每一循環將洗膜溶液的溫度提髙 2~10°C。目的是發現能引起錯配雜交分子（例如，突變的寡核苷酸和野生型序列）解離，但不影響完全匹配雜交分子的適宜溫度。
隨著不斷實踐，通過用手提式微型放射監測儀檢測毎次漂洗后的濾膜，省略漂洗和放射自顯影的一些次數是可能的。
陽性噬菌斑的純化
13. 雜交陽性的噬菌斑通常是含有突變體和野生型序列的混合物。因此，需要按以下方法從陽性雜交噬菌斑中純化噬菌體：
a. 用滅菌的木質一次性牙簽的鈍端接觸陽性雜交噬菌斑表面。
b. 將牙簽放入一個含 lml 無菌 TE(pH7.5) 的無菌試管中。將試管置于室溫 10~15 min, 不斷晃動試管，使噬菌體顆粒脫落在溶液中。
c. 用 TE(pH7.6) 對噬菌體懸液進行 l0x 系列稀釋。分別將 10ul 的 10-3,10-4 和 10-5 倍稀釋的噬菌體與 100ul 大腸桿菌（例如 TG1) 的過夜培養物混合。
d. 將 2.5 ml2XYT 頂層瓊脂（熔化并冷卻到 45°C) 加入到每份培養物中，將以上混合物鋪在單個 YT 球脂平皿上。37°C 孵育平皿 16 h, 使噬菌斑形成。
e. 用步驟 5~12 描述的放射性標記的寡核苷酸探針重新篩選噬菌斑。在第二輪篩選過程中，不需要逐步增加洗膜溶液的溫度。可將濾膜直接從室溫轉移至預熱的 (見步驟 12) 靠經驗確定溫度的 6XSSC 中。
14. 從三個雜交陽性突變體中各挑取兩個噬菌斑。按第 3 章方案 4 介紹的方法從由噬菌斑衍生而來的被噬菌體感染的小量培養物中制備單鏈 DNA。
15. 用雙脫氧鏈終止法對含靶序列的 DNA 進行測序（請見第 12 章方案 3 或 4)。可使用測序通用引物，或使用結合在突變位點上游 50~100 個核苷酸的合成引物。
16. 當突變體被確認后，用序列分析方法確證克隆進噬菌體 M13 的靶 DNA 全序列，以確保在噬菌體 M13 重組體的繁殖過程中沒有產生意外突變。這一過程通常需要每隔 200~400bp 設計一個與靶 DNA 互補的引物。
17. 對帶有所需突變而在靶 DNA 區域沒有發現意外突變的重組噬菌斑（步驟 14) 進行純化后感染細菌，并從感染的培養液中分離復制型噬菌體 M13DNA。分離、純化復制型噬菌體 M13DNA 的方法請見第 3 章方案 3。
18. 用適當的限制酶消化噬菌體 M13 復制型 DNA 和制備凝膠電泳回收突變的靶 DNA 序列。將靶 DNA 克隆進所需的載體。
19. 用幾種不同的限制性內切酶消化重組的未經誘變的靶序列，或消化重組的帶有突變的靶序列。
20.
凝膠電泳分離經限制酶消化的 DNA 片段，按第 6 章方案 8 描述的方法將 DNA 轉移到硝酸纖維素膜或尼龍膜上。用
32P-標記的誘變寡核苷酸作為探針，用低于 Tm 值 10°C 的溫度下進行 Southern 雜交。在不同的條件下洗膜并進行放射自顯影。
最行一次自顯影應僅顯示與相關的誘變靶 DNA 片段雜交信號。
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