盤繞螺旋結構的設計和優化技巧實驗

本節討論盤繞螺旋特異性設計所涉及的幾個不同方面。我們的目標是在核心處和邊沿位置選擇氨基酸以得到期望的寡聚態（ 見 3. 2.1)、特異性（見 3. 2. 2 ) 和螺旋取向 ( 見 3.2.3 )。這里，我們也把針對特定穩定性的不同設計方案聯系起來。第 4 小節（見 3. 2.4 ) 涉及整體穩定性，集中在外部位點（b、c 和 f )。本章我們把所有內容分為小節逐一討論。但是，正是由于所討論的導致盤繞螺旋形成的相互影響的各因子的本性，本節的討論會在幾個地方互相交叉。因此，對于處理同一殘基位置所起的不同作用的小節可以被認為是互相聯系的片段。

3. 2. 1 寡聚態

為正常地發揮功能，任何蛋白質都必須折疊成合適的三維結構。類似地，盤繞螺旋結構必須采取正確的寡聚（ 四級）結構。在下一小節，討論實現正確結構的主要因素。

3.2.1.1 核心殘基

圖 3.1，我們稱 a 和 d 殘基為核心殘基，因為它們繞著每一個螺旋形成疏水帶。 a 和 d 重復殘基的非極性本性，有利于沿著每一螺旋的一面發生寡聚。這與在球蛋白折疊時蜷縮成的疏水核心類似，并代表對盤繞螺旋整體穩定性的主要貢獻。結果是，核心殘基在定義寡聚態上發揮主要的作用。

位置 a 和 d 上的疏水側鏈，以 “杵適配臼”（knob- into - hole) 的方式掩埋于相鄰螺旋中，并最先由 Crick 在 1953 年所描述 [ 15 ] 。在這一模型中，一個 a 螺旋的一個側鏈 ( 杵），插入對面的 a 螺旋上的 4 個側鏈圍成的空間（臼）中，反之亦然。堆積幾何被 C_α—C_β 鍵與臼底部的 C_α—C_a 向量構成的角在螺旋底部的投影所定義。對平行二聚體而言，位置 a ( 七元重復位置 i ) 的杵，適配到另一個螺旋的由位置上的殘基順時針排列（如果對著空洞看去）而成的臼中。因而，d_i 位的杵是在 a'_i、d'_i、e'_i 和 a'_i+1 圍成的臼中（圖 3.1)。 

對 GCN4 ( Jun 轉錄因子的酵母同源物，有時稱為 GCN4-p1，見注 1 ) 盤繞螺旋不同核心突變的全面而完整的分析，揭示了不同寡聚態的不同堆積幾何（表 3.1；參考文獻 [ 16 ]）。GCN4-p1 二聚體 X 射線結構中的側鏈堆積，和一個設計的四聚 GCN4 突變體的比較，證明 a 層和 d 層的局部幾何被翻轉了。平行的杵適配白堆積在二聚體的 3 層和四聚體的 d 層。相反，垂直的杵適配臼堆積，在二聚體的 d 層和四聚體的 a 層。在平行的三聚變體中，在 a 和 d 位發現了第三類的杵適配臼堆積 [17]，在這兩層中，每個杵的 C_α—C_β 鍵與在對應臼底部的 C_α—C_β 鍵成近似的 60° 角。這一安排稱為“尖銳” 的杵適配臼堆積。



這些不同的幾何關系，解釋了一定的寡聚態有獨特的氨基酸偏好。下面列出幾個實驗結果，這些實驗測試不同氨基酸對穩定性和寡聚特異性的影響。

( 1 ) 特異的疏水殘基在強制盤繞螺旋采用何種寡聚態上是關鍵的。Harbmy 等系統地把 GCN4 ( 除 a1Met 外）所有的 a 和 b 殘基改變為 Leu、Val 或 lie ( 見注2 ; 參考文獻 [16])。如表 3.1 所示，這使得盤繞螺旋采用不同的寡聚態。GCN4- IL ( IL 指 a 位的 lie 和 d 位的 Leu)、II 和 LI 突變體分別是二聚、三聚和四聚，并且在研究的整個濃度范圍內（寡聚態）與濃度無關。VI、VL、LV 和 LL 突變體以多種方式寡聚。 L、V 和 I 的每一個組合給出獨特的堆積偏好，因而形成獨特的幾何特征。

a. 帶 β 分支的殘基（Val 和 lie ) 適合于平行的杵適配臼堆積（二聚體的 a 層和四聚體的 d 層），而 γ 分支的殘基 Leu 適合于垂直的（二聚體的 d 層和四聚體的 a 層）幾何特性。相反， β 分支的氨基酸插入垂直位，需采用熱力學不利的旋轉構象態 [18] 。

b. 很有可能，lie 和 Val 雖有相似的立體化學，但在建立寡聚態上是不等價的。在 a 位 的 Val 導致二聚體的能力比 lie 弱。與 Val 導致二聚-三聚混合物相反，lie 給出較高的二聚特異相互作用。

c. 與二聚體和四聚體結構相反，三聚體內部的堆積，在兩個疏水位點，可以適應具有最適旋轉構象態的 β 分支殘基。

( 2 ) 在 Woolfson 和 Alber 的研究中，包括了對核心殘基作用的研究，并把這些作用用來衡量七元重復殘基的二聚和三聚傾向 [19] 。分析二聚體和三聚體的特性，并用這些特性來鑒別新的序列。掩埋的 Leu、lie、Asn、Lys 和 Gin 在其預測算法中是關鍵的，稱之為 COILER。總的來說，使用了 21 個已知形成二聚體和三聚體的不同的蛋白質，相當于數據庫中的 721 個七元重復。

a. 在起先考慮的 7 種氨基酸中（Ala、Phe、lie、Leu、Met、Val ) ，只有 a 位的 lie 和 Leu 以及 d 位的 Leu 在統計意義上被觀察到。二聚體偏好 a 位富集 lie 和 d 位富集 Leu，而二聚體中的 d 位幾乎沒有 lie。很清楚，在這些位置上對氨基酸的這些選擇使二聚體的形成有最好的堆積幾何 [ 見 3.2.1.1 中（1 ) 和 表 3.1]。

b. 在盤繞螺旋序列的核心部位，Val 比 lie 分布得更均勻。在二聚體和四聚體的 a 位 和 d 位，Val 出現的頻度甚至低于隨機分布的預期值。這些結果與觀察到的下述事實相符：a 位和 b 位的 Val 很難區分盤繞螺旋的二聚態和三聚態 [ 第 3.2.1.1 中（1 ) 和表 3.1]。

c. 三聚體中 a 位 和 d 位的堆積是差不多的，這些位置對氨基酸少有特異性，使得疏水氨基酸的分布更均勻 [ 16，19] 。

( 3 ) 在研究設計好的反平行盤繞螺旋核心位置的丙氨酸的位置效應時（見注 3 )，Monera 等發現，當丙氨酸殘基在適當位置（即在同一個環上）時，會形成二聚體 [ 20 ] 。如果丙氨酸殘基不同步，會形成四聚體。對此，最可能的解釋是，四聚體中同步丙氨酸形成的孔穴高度地不穩定，因而傾向于形成二聚體，而 Leu-Ala 重復使孔穴分布在較大范圍內，從而減少在疏水掩埋和范德華相互作用上的損失。這證明了寡聚特異性是核心殘基堆積引起的。

( 4 ) 軟骨寡聚基質蛋白質（COMP ) ，屬于血小板反應素家族，包含 5 鏈的非常穩定的平行 α 螺旋盤繞結構。46 個氨基酸長的盤繞螺旋區域（見注 4 ) 包含環分子間（即螺旋與螺旋間）的半胱氨酸二硫鍵 [21]。五聚界面展示出杵適配臼堆積。a 位、d 位、e 位和 g 位殘基構成若干杵，它們堆積入相鄰亞單位的 a'-g' 位、d'-e' 位、c'-d'位和 a'- b' 位側鏈圍成的臼中。只有 f 位殘基是完全暴露的，而其他 6 個位置的殘基是明顯被掩埋的。GCN4-pLI 突變體 [ 見 3.2.1.1 中（1 ) ] 和五聚的 COMP 結構都含有一個大的軸向孔洞。在四聚體中的隧道大小為 1.0~1.3 A [16]，并因此而排除了水分子（半徑 1.4A)。相反，沿著五聚體的小孔有幾個小分子，這與其隧道的半徑較大（2~6A）一致。

( 5 ) 把 d 殘基改變為性質上更疏水的非天然氨基酸（三氟亮氨酸和六氟亮氨酸）的實驗顯示穩定性增加（見注 5；參考文獻 [ 22 ] 和 [ 23 ])。

( 6 ) 用單甲基、雙甲基和三甲基化的二氨基丙酸（dap) 類似物研究了 a/d 界面上的疏水掩埋，結果顯示疏水性增加 [22] 。甲基加入一個單體的第 16 位（在類肽的第 16 位用天冬氨酸）時，使隨后得到的雜二聚 GCN4-p1 ( 見注 6 ) 更穩定，可能是由于折疊狀態的范德華相互作用得到增加和降低了折疊的溶解損失。但是 3 個甲基的加入降低了穩定性，可能是由于增加了立體化學的位阻。奇怪的是，2 個甲基加入合成的 dap 后，引起了齊三聚（ 相同蛋白質或多肽的結合稱為齊聚或同聚——譯者注）。這證明了即使是小的尺度和疏水性的變化也能夠改變穩定性與折疊傾向。

簡而言之，在二聚的盤繞螺旋中，核心位置氨基酸的最好選擇可能是 d 位 Leu、a 位 ( β 分支的 lie ( 或 Val)。如果使用了 Val，Asn ( 如同在天然盤繞螺旋中普遍見到的）就應該相應地放在中心 a 位，以增加相互作用的特異性（見 3.2.1.2 )。三聚體的最好設計是核心位都用 lie，而四聚體最好在 a 位用 Leu，d 位用 lie。對這種 β/y 側鏈分支 ( 殘基）安排的偏離，會導致不利的旋轉異構能，降低所期望的結構穩定性，并可能產生盤繞螺旋的多種寡聚態和反平行結合態的混合，也就是使得特異性降低。

3.2.1.2 極性核心殘基

與核心殘基整體上疏水相反，大約 20% 的核心殘基是帶電的 [ 25 ] 。這些帶電殘基通常起到使結構形成正確寡聚態的作用，大概是通過保證螺旋在結構中按需要的方式排布，否則結構將以二聚、三聚和（或）四聚，以及平行和反平行混合物的形式存在。但是，通常在特異性上的所得，總伴隨著穩定性的降低。以下列出這些殘基在特異性和穩定性上的作用。

( 1 ) 在關于二聚體和三聚體的統計分析中 [ 見 3.2.1.1( 2 ) ] ，Woolfson 和 Alber 觀察到：

a. 二聚體中 Lys 和 Asn 偏向于在 a 位，而三聚體中則基本沒有。在二聚體的 a 位找到 Asn 的可能性比在三聚體中大 3 倍。

b. 三聚體的 a 位富含 Gln，Ser 和 Thr 則富集在 a 位或 d 位。

c. 常常與側面 e 位和 g 位上的谷氨酸一起，在 a 位找到掩埋的賴氨酸。例如，這可以在 Jun/Fos 雜二聚體 [26] 以及 GCN4 Asn6Lys 突變體的 X 射線結構中找到 [ 見 3.2.1.2 ( 5 )；參考文獻 [27] ]。

( 2 ) 掩埋的 Asn 對（在處于合適的位置時），可能通過兩個螺旋的兩個 Asn 側鏈之間生成的氫鍵，給二聚體以特異性，這一現象確實在 X 射線 [6] 和核磁共振 [28] 研究中被觀察到。不滿足 Asn 側鏈的氫鍵位能的其他構象因而在能量上是不利的。

( 3 ) 如果 GCN4 -p1 核心 a 位的 Asn ( 見注 2 ) 被替換為 Val，以二聚化的特異性為代價，盤繞螺旋的穩定性大量增加。因為與 lie a 位的 Val 使得特異性缺失，Harbury 等報道得到了二聚體和三聚體的混合物 [ 見3.2.1.1 ( 1 ) 和表 3.1；參考文獻 [16] ]；同時，Potekhin 等報道了三聚體生成 [29] 。

( 4 ) 在另一個例子中，平行雜聚肽（見注 1 ) 的核心 Asn 對突變為 Leu 對（產生 Acid- pLL 和 Base-pLL 多肽），得到平行和反平行四聚體混合物 [ 30 ]。

( 5 ) 在 GCN4 的情形（見注 2 )，Alber 組把核心 a 位的 Asn 對改變為 Gln 和 Lys，以研究這是否也能得到寡聚特異性。Lys 產生的二聚體與野生型相似，而 Gln 產生二聚體和三聚體的混合物 [27]。他們推論為，極性基團制約的結構唯一性，不只是由極性掩埋引起的，也依賴于側鏈與環境的正確相互作用。這些與上下文有關的效應，比起僅只是給定的七元重復位置的殘基頻度來，預測困難要大得多。

( 6 ) 當用一個蛋白質片段的互補試劑（見 3. 2. 5. 3 ) 二氫葉酸還原酶選擇雜二聚的盤繞螺旋時，Arndt 等發現，在一個是 Val-Leu 的核心處，相比于 Asn-Val 或 Val-Val 組合 Asn 對構成的核心更受青睞（見注 7；參考文獻 [31])。這與許多天然的盤繞螺旋相符合。

( 7 ) 在另一個研究中，二聚的 GCN4-pVL [ 見 3.2.1.1 ( 1 ) ] 的 a 位或 d 位被分別突變為極性殘基 Asn、Gln、Ser 或 Thr ( 見注 8；參考文獻 [25])。只有 a 位的 Asn 殘基對和 d 位的 Thr 殘基對能導致正確的寡聚態。可能是掩埋這些殘基在核心中所損失的溶解能，被它們間的相互作用能所彌補，因而也能保證正確的螺旋安排。

( 8 ) 堆積環境的差別使疏水殘基有不同的傾向性，即使是在 a 位和 d 位。在兩個應用 a 位為 Val、d 位為 Leu 的模型多肽的透徹研究中，中心的 a 位和 d 位被系統地改變為每一種氨基酸，以測試它們在穩定性和寡聚態上的作用（見注 9；參考文獻 [ 32 ] 和 [ 33 ])。這些改變，是有關疏水核心側鏈替換對雙鏈盤繞螺旋穩定性影響的第一個透徹的定量評估，并使得為 a 位和 d 位 19 種天然氨基酸建立熱力學相對穩定性標度成為可能。表 3.2 列出了那些如果放在 a 位或 d 位會導致明確的寡聚態的氨基酸 [32]。A 位的 Leu-、Tyr-、Gin- 和 His- 取代類似物無一例外地是三鏈的，而 Asn-、Lyt、Om-、Arg- 和 Trp- 取代類似物無一例外地形成兩鏈單體。在中心 d 位替換的時候，lie 和 Val  ( β 分支殘基）導致三鏈寡聚態 [ 見 3.2.1.1(1) ]，而 Tyr、Arg、Lys、Orn、Glu 和 Asp 產生雙鏈態。



( 9 ) Ji 等突變了 gp41—— 來自猿猴免疫缺陷病毒的 6 螺旋束包膜蛋白，與 gp120 一起，負責病毒與 CD4⁺ 細胞的融合 [ 34 ] 。在結構上，它是由反平行雜二聚體組成的三聚體蛋白。在這一研究中，為核心氫鍵和鹽橋負責的（兩個 Gln 和兩個 Thr 殘基）4 個被掩埋的極性殘基的每一個，都單獨地突變為 lie。其中，3 個形成更穩定的 6 螺旋束，另 1 個形成不溶的聚集體（見注 10)。這些結果證明了這些殘基具有控制結構穩定性和特異性間平衡的能力。這是非常重要的，因為在融合之前，此蛋白質要經受結構變化，并必須在兩個結構之間有正確的穩定平衡，以使得這種變化是可能的。這些極性核心殘基協助調控此構象穩定性，因而，也協助膜融合本身。

一般來說，核心 a 位的 Asn 殘基對顯然在二聚體中占支配地位，特別是，如果核心偏離最優的 Ile-Leu a-d 殘基布置的時候，因為這一組合似乎導致平行二聚，而不需要核心內的 Asn 對。核心的 a 位 Gln 對三聚體可能是好的選擇，盡管為了確保三聚體排它的特異性，可能還需要其他一些因素。

3.2.1.3 邊沿殘基

七元重復的 e 位和 g 位（邊）在盤繞螺旋界面上從側面圍著 a 殘基和 d 殘基（圖 3.1)。這些位置的掩埋，高度地取決于寡聚態。結果，在 e 位和 g 位氨基酸的選取可能受到寡聚態的影響。表 3.3 顯示掩埋面積的百分數，表示在螺旋單獨存在時的側鏈可及表面積在寡聚態中變成掩埋狀的分數 [16] 。



( 1 ) 與二聚體中對應位置相比較，三聚體的 e 位和 g 位富含疏水殘基（lie、Leu、Val、Phe、Tyr 和 Trp ) 并幾乎沒有特異的親水殘基（Glu、Gln、Ser 和 Arg；參考文獻 [ 19 ] )。這些模式是與三聚體中疏水界面相對于二聚體的擴張相符的。疏水殘基百分數的增加使狹窄的疏水面的寬度增加，并且高寡聚態的似然率也增加了。在高寡聚態中有比兩螺旋的盤繞螺旋更多的非極性掩埋。這可以從表 3.3 中看出。在 e 位和 g 位的疏水掩埋百分比，大約增加了 40%。三聚體中在對面帶電的 g_i 到 e'_i+1 殘基對（12% ) 相對于二聚體（23% ) 的減少與此相符 [19] 。

( 2 ) Fairman 等突變了 lac 阻遏蛋白的 C 端同四聚盤繞螺旋結構域，以產生雜四聚盤繞螺旋 [ 35 ] 。在 e 位和 g 位周邊的 b 位和 c 位，全為 Lys 或全為 Glu 的多肽，結合力很弱。但是，把它們混合起來，就會形成高度穩定的四聚體（見注 11)。這證明了，至少對于四聚體，b 和 c 殘基在盤繞螺旋的穩定性上也起了重要作用。這種作用類似于二聚盤繞螺旋中存在的 g/e' 離子相互作用，但四聚體加寬了的疏水界面擴展到這些殘基，離子作用從核心幵始向外后退到 b 和 c 殘基。通過改變 pH 和鹽的水平，Glu 和 Lys 間的這些離子對相互作用，被證明為對穩定性的增加負責。另外，這些電荷在齊性寡聚時直接相對，并且很可能在潛在的齊二聚相互作用體中，這一不利的電荷排斥推動了雜二聚體的形成 [ 9，35 ]。

3.2.2 配對特異性

本節討論配對特異性的重要性，以及盤繞螺旋可以用來保證沒有其他能量上有利的結構可以被接受的某些方法。引人注目的是，與序列和結構上的相似性相反，盤繞螺旋偏向于與功能上的伙伴相互作用。本節分析介導這種高特異性的因素。

3.2.2.1 核心殘基

如 3.2.1.1 小節所述，疏水殘基（主要是 Leu、lie 和 Val ) 分布模式是螺旋間結合的主要推動力。但是，因為這種模式非常常見，螺旋怎樣能同時用其核心抗拒不同結構 的形成？答案是一個復雜的圖像，包含微妙的變化，如非穩定化的、非疏水的核心殘基的插入，這種變化會選擇對抗另外種類的結構。

( 1 ) Sharma 等設計了一個多肽（anti- APCp1) ，其目的是用于結合來自腺瘤性結腸息肉（APC ) 的腸癌有關腫瘤抑制蛋白的盤繞螺旋序列（見注 12；參考文獻 [36])。 這樣，他們采用了核心改變以及結合 g/e' 相互作用，而不是 Asn 配對，以證實特異性可歸因于這個相互作用。他們推理認為，考慮到核心殘基在結合過程中的主導作用，以及核心突變對穩定性和特異性都有大的影響，發現在主導特異性上對核心殘基的低要求是令人奇怪的。為了處理這個問題，他們設計了 1 個多肽，以結合到 APC 的頭 55 個氨基酸（APC55 ) 上，并基于角蛋白的類型 I 和類型 II 雜二聚體在位置 a 和 d 的共變模式，突變了此 anti- APCp1，以產生更常見的 a-a' 和 d-d' 配對。他們做了 3 個突變（在 a 層的 A41 I、d 層的 A2M 和 M44A )，以把野生型的 Ala-Ala 和 Met-Met 相互作用分別變為更常見的 Ala-lie、Ala-Met 和 Met-Ala 相互作用。兩個更進一步的突變（a 層的 T6G 和 d 層的 N30H ) 用對應的 Gly-Gly 和 His-His 對來降低齊二聚體的穩定性。在定向抗 anti-APCp1 齊二聚化的同時，額外的 e-g' 配對優化了離子相互作用，所得二聚體具有穩定性及特異性。

( 2 ) Schnarr 和 Kennan 通過核心疏水殘基的立體化學配合形成了雜三聚蛋白 [37] 。 在他們的研究中，用各種不同側鏈長度的非天然氨基酸來啟動特異的雜三聚體形成。 研究者們把 GCN4 核心 a 位殘基用 Ala 或環己基丙氨酸替代（見注 13)，結果得到的是三聚體中立體化學不匹配的核心層，以 3 個 Ala 或 3 個環己基丙氨酸，產生立體規避或排斥。但是，2 個 Ala 和 1 個環己基丙氨酸產生了 1 個立體化學配合很好的雜三聚體。非天然側鏈可以以這種方式產生盤繞螺旋。環己基丙氨酸的額外體積彌補了 Ala 核心層，以提供立體配合，而更大的側鏈只會使分子不穩定。

3.2.2.2 極性核心殘基

在 3.2.1.2 討論了極性核心殘基在引導螺旋特異的寡聚態上的作用。在 3.2.1.1 曾提到，在盤繞螺旋配對中的異型核心接觸允許產生雜特異性。更多的特異性可通過極性核心與外沿殘基的相互作用得到。

( 1 ) 在天然二聚盤繞螺旋中，a 位的 Lys 是僅次于 Asn 的最普通的掩埋極性殘基 [19] 。A 位 Lys 可以與前 1 個七元重復的 e 位殘基 [27] 形成螺旋內靜電相互作用，以及與平行二聚體中，對面螺旋前 1 個七元重復的 g' 位的極性殘基，形成螺旋間 g'-a 極性相互作用 [26]。

( 2 ) Campbell 和 Lumb 在肽拉鏈（PV) 的 Base-pLL 中放入了兩個 a 位 Lys，以在肽拉鏈的 Acid-pLL 中實現螺旋間的由這 2 個 Lys 與 e' 和 g' 位的 Glu 殘基提供的極性相互作用（見注 14；參考文獻 [38])。正如所期待的，結果偏向于二聚態，很可能是因為在高寡聚態中會有較大的溶解損失。另外，這樣的相互作用，相比于 Asn-Asn (a-a') 相互作用，對穩定性的損害較小，主要是因為后者有較大的溶解損失需要付出。然而，平行和反平行的皆有可能，主要是因為，平行取向中的 a-g' 相互作用和反平行取向中的相互作用在能量上是相似的。

( 3 ) Harbury 的組采用計算方法 [ 見 3.2.5.4 (4)]，不僅考慮期望的結構，而且考慮不同的不期望的結構，以實現特異性 [39] 。改變了 GCN4 的中心七元重復的 a 位、d 位、e 位和 g 位殘基（見注 15 )；所有非脯氨酸殘基以及同型和異型序列都經受了計算選擇和實驗驗證。次于 g/e' 殘基對的體積互補和電荷互補，發現 d 位的 Glu 寧愿與 e' 位的 Arg 配對。

3.2.2.3 邊緣殘基

配對特異性受到 e 位和 g 位殘基靜電本質的影響（在平行二聚螺旋中，一個七元重復的 g 位與另一個螺旋的下一個七元重復的 e' 位，被記為 i→i’+5 )。這些殘基常常分別是 Glu 和 Lys。這樣互補的殘基對相互作用，分別增加并鞏固原來由核心疏水作用提供的特異性和穩定性。盤繞螺旋外接觸邊緣的電荷模式會指導蛋白質是形成齊聚還是雜聚蛋白，以及盤繞螺旋內的取向是平行的還是反平行的。但是，PV 假定（見第 1 節；參考文獻 [ 8 ] ) 過分地簡單化；那些在復合物穩定性上很少有或沒有作用的殘基，通過指導螺旋避開，那些會危及分子的特異性的，同樣的或不期望的相互作用來達到其目的（負設計）。另一方面，某些盤繞螺旋似乎沒有經受到進化壓力，因為它們已經是特異性的，并且也不需要比它們現在的狀態更穩定。

( 1 ) 如所期待的，用排斥的 Glu-Gk 配對取代有利的 g/e' 位 Gin-Gin 配對已被證明使盤繞螺旋構象不穩定 [ 40]。

( 2 ) Hodges 及其同事估計 g/e' 配對鹽橋對盤繞螺旋穩定性的貢獻是 0.37 kcal/mol ( 見注 16；參考文獻 [41])。

( 3 ) 細心 e 和 g 位電荷，可容許雜二聚體的生成，并另外保證，如 PV 假定所包含的，不傾向于生成齊二聚體[ 9，42，43] 。

( 4 ) 在 e 位和 g 位找到的 4 個最常見的氨基酸是 Glu、Gln、Arg 和 Lys。這些殘基含有長疏水側鏈，能夠與 a 和 b 核心殘基作用，并終止于一帶電（Glu、Arg 或 Lys) 或極性（Gin) 基團。通過先突變 e，而后 g，最后兩個七元重復對上的殘基為 Ala，Krylov 等針對雞的卵黃蛋白原結合蛋白成功地建立了這些相互接觸殘基的耦合能 ( 見注 17)。這一雙突變熱力學循環被用來為外沿殘基接觸的傾向建立熱力學標度（表 3.4)。在 150 mmol 氯化鉀和 pH 7.4 的條件下，Glu-Arg 吸引被證明比 Glu-Lys 吸引稍微穩定，合理的解釋是，Arg 的側鏈較長并較好地與谷氨酸相互作用，而且，各個甲基更有效地把核心與溶劑屏蔽開。這樣的后果是增加帶電末端基團的作用，在較弱的水性環境中產生較大的貢獻。如所預期的，高鹽像低 pH —樣，弱化這些相互作用。在高鹽或低 pH 條件下，極性作用減弱，疏水作用增強。Glu-Arg、Glu-Lys 和 Gin-Gin 相互作用是最具穩定能力的（與取向無關）。而 Glu-Glu、Arg-Arg、Arg-Lys、Lys-Arg 和 Lys-Lys 這些相同電荷的相互作用相當地不受歡迎。



( 5 ) Arndt 等設計了一個多肽庫。此庫的設計基于 Jim-Fos 雜二聚，庫中 b、c 和 f 殘基來自于各自的野生型蛋白，a 位和 d 位為 Val 和 Leu ( 帶有 a3Asn 在核心的插入例外，此插入引導期望的螺旋取向和寡聚態），e 和 g 殘基則用三核苷酸作改變以得到等摩爾的 Arg、Lys、Gin 和 Glu 混合物（見注 7；參考文獻 [8])。出人預料的是，最好地選擇出來的成功者-Winzip-A2B1 雜二聚體（見注 18)，在 g/e' 位缺少完全互補的帶電殘基，盡管選擇過程是很徹底的。更確切些說，6 個 g/e' 對的兩個預測為排斥的，提示得到的序列偏離簡單的電荷互補規則（ PV 假設)。可以假定，整體靜電勢（包括分子內和分子間相互作用）起主要的作用，并且與核心殘基的作用，如像有利的堆積或立體沖撞，也可以調節這些 g/e' 作用（見參考文獻 [ 8 ] 和 [ 31 ] 及其中引用的文獻 )。這樣的觀察與天然發生的盤繞螺旋相符，這些天然結構通常有復雜的相互作用模式。這些盤繞螺旋必須滿足一些標準，如生物穩定性和在家族內的極高特異性，而與其他盤繞螺旋家族間沒有交叉反應 [46]。

3.2.3 螺旋取向

盤繞螺旋多數折疊為平行排布，但是，越來越多的測定了結構的蛋白質含有反平行的盤繞螺旋結構域 [47] 。與反平行盤繞螺旋的生物學重要性逐漸得到承認相反，對這類分子的研究被沒有行為規范的模型體系所牽制。例如，在像絲氨酰轉移 RNA ( t RNA ) 合成酶或丁型肝炎抗原那樣的蛋白質中發現的反平行盤繞螺旋，都被證明足以實現沒有更進一步結合的二聚化。

Hodges 及其合作者第一個報道了全新設計的，被內部二硫鍵限定在反平行取向的盤繞螺旋的表征 [48] 。這一以及其他設計的反平行盤繞螺旋，分別比它們的有幾乎等價的螺旋間相互作用的平行對應物更穩定 [49，50]。這些數據顯示，假定其他一切都是等價的，螺旋偶極相互作用（見 3.2.4.3 ) 偏好反平行取向。

3.2.3.1 核心殘基

在平行盤繞螺旋中，互相堆積的核心殘基有 a-a' 和 d-d'。在反平行盤繞螺旋中有 a-d' 和 d-a' 中心堆積，產生同樣的堆積層 [51]。

( 1 ) 已經證明，Ala 殘基在全新設計的盤繞螺旋核心的相對位置可以控制平行或反平行取向 [ 見 3.2.1.1 ( 3 )；參 考文獻 [52] ] 。通過細心地放置 Ala 在中間的七元重復中，全平行的或全反平行的四聚體都可以形成。在分子中間核心位置的七元重復的中間兩層平面用另一種不同的殘基對 Ala 和 Leu (Ala- Leu- Ala- Leu) ，也可以達到同樣目的。這樣由大小兩種殘基交替組成的核心（Ala- Leu- Ala- Leu) 是引入小側鏈的最好辦法。在平行安排中，堆積會是在一個平面中都是 Ala，而另一個平面中都是 Leu，于是導致一個大空洞從而溶解核心并使分子不穩定（ 見注 19)。

( 2 ) 在一個類似實驗中，二聚的 GCN4-p1  ( 見注 2 ) 核心 Asn 被變為 Ala。結果是得到反平行三聚體，以避免核心空洞 [53] 。但是，在苯存在的條件下，得到的是平行三聚體，苯結合在核心空洞中。

( 3 ) 在最近稱為 APH 的反平行同二聚盤繞螺旋的設計中，疏水核心中的 β 分支的立體匹配（lie 于 d 位）和截斷的側鏈（Ala 于對面的 a' 位）以及其他特性 [也見 3.2.3.3 (3)] —起被用來啟動反平行取向。平行排布在 lie 的 d 層是能量上沒有優勢的，從而很差地被放在二聚盤繞螺旋中（見 3.2.1.1 )，和疏水核心的 Ala-Ala 空洞從能量上排除（見注 20)。

3.2.3.2 極性核心殘基

與平行盤繞螺旋相似，與對應掩埋的極性殘基也在規定螺旋取向上起到關鍵的作用。

( 1 ) 在平行盤繞螺旋中，普遍地觀察到 a-a' 的 Asn 配對 ( 見 3.2.1.2 )。但是，在反平行盤繞螺旋中，對應的 a-d' 位并未觀察到這種配對（綜述見參考文獻 [47])。確實，在反平行盤繞螺旋中的 Leu-Leu 相互作用比在平行的核心堆積中更穩定 [49]，并且很可能是 Asn-Asn 相互作用和靜電相互作用（見 3.2.2.3 和 3.2.3.3 ) 導致平行構象相對于反平行構象的特異性。

( 2 ) 盡管在天然蛋白中沒有 Asn-Asn a-d' 配對，Oakley 和 Kim 修飾了平行雜二聚盤繞螺旋肽拉鏈，使得僅當螺旋在反平行取向時，才可以存在掩埋的極性相互作用， ( 即 a-d' 配對；參考文獻 [56])。據估計，這一掩埋的極性相互作用給予約 2.3 kcal/mol 中等程度的反平行偏向（見注 21)。但是，僅在掩埋的極性相互作用與引進平行取向時電荷排斥兩者結合時，才能排它性地形成反平行盤繞螺旋 [見3.2.3.3 (2)]。

( 3 ) 與在平行二聚盤繞螺旋中存在的 a-g' 或 d-e' 相互作用可以比較（見 3.2.2.2 )， a-e' 或 d-g' 相互作用可以出現在反平行盤繞螺旋中。例如，在絲氨基 tRNA 合成酶盤繞螺旋中，一條鏈上 d 位的 Arg-54 和另一條鏈上 g' 位 的 Glu-74 [ 57]，或者在 GreA 盤繞螺旋中的 a-e' 相互作用。據假定，這種類型掩埋的極性相互作用也可能在取向特異性中起作用。Oakley 的小組取代了肽拉鏈的核心 Asn 殘基對，以使得在反平行取向中，Acidpi 的 a 位  Arg可以與 Basepl 的 g' 位 Glu 作用（見注 22；參考文獻 [59])。平行構象的穩定性會被潛在的 e' 位 Lys 的排斥作用降低。但是，與 Campbell 和 Lumb 的研究一致 [ 見 3.2.2.2 ( 2 ) 和注 14；參考文獻 [38]]，雖然核心引進 Arg 后能夠促進二聚化，但并未發現對反平行或平行取向有明顯的偏好。兩種狀態的自由能差估計僅有（0.1±0.1 )  kcal/mol。一個可能的解釋是歸因于與鄰近的 g 位 Glu 形成了螺旋間相互作用。

3.2.3.3 邊緣殘基

在平行盤繞螺旋中，極性的 e 位和 g' 位產生有利的作用。在反平行的盤繞螺旋中，e 與 e' 作用，g 與 g' 作用，結果是一個螺旋被等效地旋轉了 180°。這種傾向性的改變，在取向選擇上有著重要作用。

( 1 ) Monem 等設計了平行的和反平行的盤繞螺旋，預計會有鏈間吸引或排斥 ( 見注 23； 參考文獻 [49] )。確實發現，在主要的取向中有帶相反電荷氨基酸間的靜電相互作用。

( 2 ) Oakley 的小組改進了早先設計的反平行雜二聚盤繞螺旋 [見 3.2.3.2 (2)]。 在他們的第一個設計中 [56]，在 e 位和 g 位，一條肽鏈僅含 Glu，另一條肽鏈僅含 Lys ( 見注 21)。在他們的新設計中，替換了每條肽鏈的 g 位殘基，以使得所有潛在的吸引作用都預計只在反平行取向存在（見注 24；參考文獻 [60])。相反，兩個潛在的庫侖排斥作用預期存在于平行取向中，并且確實證實了反平行排布的強烈向。

( 3 ) 在最近設計的反平行齊二聚盤繞螺旋 APH [ 也見 3.2.3.1 (3)]，N 端 e 位和 g 位的 Glu 與 C 端 e 位和 g 位的 Lys 被用來引導反平行取向，結果在反平行排布得到 8 個潛在的庫侖作用，在平行排布得到 8 個潛在的排斥作用（見注 20；參考文獻 [55])。

3.2.4 穩定性

達成有利的穩定性是大量效果相反的焓和熵的凈結果。結果是得到一個具中等程度穩定性的蛋白質，進化后可以在生理條件下與其伴侶蛋白相互作用，但不是穩定到不會解離的程度。達到這個平衡，是核心和邊緣殘基以及它們的相互作用、螺旋長度、成螺旋的傾向、溶解度和螺旋戴帽的結果。本節討論這些穩定化因素。

一個重要而微妙的因素是溶解度。參與的螺旋必須有一非極性內核，以容許有利的相互作用，但螺旋的整體非極性必須不至于強到在工作條件下發生聚集。殘基 a 和 d 必須形成一個連接兩個螺旋的疏水帶，e 和 g 典型地應該是極性殘基，參與保證只有真正的結合伙伴與螺旋作用（即與非作用伙伴結合時變得不穩定），并增強核心導致的穩定性。這把剩下的殘基留在了七元重復中的位置 b、c 和 f 上，以使電荷平衡和保證螺旋穩定且可溶。Glu 和 Lys，也有非常適合的螺旋傾向。帶電殘基也可與螺旋偶極有利地作用 ( 見 3.2.4.3 )，還可以與螺旋內一圈以外的帶電殘基