CRISPR女神創辦公司放“大招”

　　CRISPR的火熱及其在臨床上應用的美好愿景，令這一技術相關的公司不斷涌現，除了張鋒等人創辦的Editas Medicine，Emmanuelle Charpentier等人的ERS Genomics，另外一位CRISPR先驅Jennifer Doudna也創辦了自家公司：Caribou Biosciences，這家公司2015年與杜邦達成戰略合作，推進兩家公司基于CRISPR的基因組編輯技術平臺的發展。

　　5月1日這兩家公司合作完成的最新研究成果：Mapping the genomic landscape of CRISPR–Cas9 cleavage，公布在Nature Methods雜志上，提出了最新的檢測技術，并為我們展現了CRISP-Cas9全基因組范圍內的剪切位點。

　　來自CRISPR-Cas微生物免疫系統的RNA導向內切酶Cas9已經成為有力的基因組編輯工具，能用于多種生物中，進行基因和非編碼遺傳元件的編輯修飾。目前Cas9介導的基因組編輯技術已經被應用到了眼、耳、肝和肌肉相關疾病的治療中，但是組織特異性傳遞不理想依然是一個問題，這主要是因為幾方面的原因，如直接整合到基因組DNA上，由細菌Cas9蛋白在編輯細胞中的持續表達引起的免疫應答和脫靶編輯。

　　此前研究人員曾提出過一種解決辦法，就是利用非遺傳編碼，預組裝和短壽命的Cas9核糖核蛋白（RNP）復合物，這種復合物由單個導向RNA（sgRNA）和Cas9（sgRNP）組成，通過與兩個DNA區域（protospacer和PAM）序列特異性作用，從而識別DNA。Protospacer主要通過靶標DNA與一個位于sgRNA的5'末端，長為20-nucleotide的互補序列之間的堿基配對來完成反應，而PAM結合則是由C-末端PAM作用結構域中的Cas9氨基酸殘基與靶標DNA之間的直接相互作用來促進。Cas9可以容忍由于protospacer和PAM識別錯配，導致的脫靶核酸酶活性。

　　檢測脫靶效應的實驗方法

　　雙鏈斷裂（DSB）的細胞修復可能會導致誘變插入或缺失（indel），甚至出現較大的染色體重排。因此，科學家們希望能通過全基因組檢測sgRNPs的脫靶剪切，尤其是目前CRISPR-Cas9已經被用于了多種各種生物技術應用。

　　近年來研發出了不少檢測脫靶剪切酶活性的實驗方法，比如2014年麻省總醫院的GUIDE-seq（Genome-wide Unbiased Indentification of DSBs Evaluated by Sequencing），即利用一種短雙鏈寡核苷酸來標記CRISPR-Cas誘導的脫靶斷裂，測序這些標簽所在的基因組區域，就能夠確定脫靶突變的位置。此外其它還有幾種基因組檢測方法。

　　但是這些技術都存在局限性：利用合成突變文庫的方法存在本身文庫設計上的偏向性；全基因組技術如GUIDE-seq和HTGTS依賴于細胞事件（供體序列的整合或染色體易位）。這些方法會導致DNA修復中的位點和細胞系依賴性差異，以及編輯事件和細胞分裂之間相互作用的混淆。Digenome-seq可以通過測序基因組DNA，來檢測Cas9切割位點，但這需要高讀取深度。因此，Digenome-seq也會缺乏檢測可能Cas9-sgRNA切割位點全部譜帶的敏感性，而且它也不適用于篩選大量的導向RNA。

　　SITE-Seq新技術

　　為了解決這些問題，在這篇最新文章中，研究人員研發出了一種新生化方法，通過測序（SITE-Seq方法）選擇性富集和識別標記基因組DNA末端，從而在純化的基因組DNA中找到Cas9的切割位點。

　　( SITE-Seq 流程)

　　SITE-Seq是一種生物化學檢測方法，因此基因組DNA可以通過一系列sgRNP濃度進行消化，從最低到最高，從而可以進行高分辨率和低切割靈敏度的脫靶位點鑒別，這樣研究人員就可以細致全面的檢查細胞中可能的脫靶位點，檢測突變頻率和功能性細胞影響。而且SITE-Seq也能創建高度富集sgRNP切割片段的測序文庫，幫助以最小的讀取深度進行特異性分析，這是將SITE-Seq作為高通量指導選擇工具的一個至關重要的特征。

　　最終，研究人員利用SITE-Seq來描繪了一組sgRNP生化切割的圖譜，檢測了靶向人類基因組的sgRNA的Cas9特異性，這些位點的數目取決于sgRNA序列和核酸酶濃度，在較低濃度下鑒定的位點顯示出細胞中脫靶突變的傾向性較高，脫靶位點列表也指出細胞內Cas9活性受到sgRNP遞送，細胞類型和暴露于核酸酶的持續時間的影響。

　　這項研究證明SITE-Seq方法可以用于識別基因組DNA中的剪切位點序列，而我們在評估核酸酶活性和特異性時，可以將脫靶位點生化簡單方法，與單獨的細胞活性檢測方法相結合，這樣能得到更好的效果。

　　CRISPR各路公司

　　Caribou Biosciences與Editas Medicine、CRISPR Therapeutics是致力于CRISPR技術應用開發的三家主要公司之一。2013年11月25日，CRISPR先驅張鋒依靠4300萬美元的風投創辦了 Editas Medicine，CRISPR女神 Jennifer Doudna也是聯合創始人。張鋒獲得CRISPRZL之后，Jennifer Doudna與公司中斷關系，并將自己的知識產權授權給了Intellia Therapeutics，同時創立了Caribou Biosciences。

　　Intellia Therapeutics

　　“開發潛在的治療性基因編輯治療，積極改變那些生活在生命邊緣的患者生活”

　　Intellia Therapeutics成立與2014年，總部位于美國馬薩諸塞州劍橋市，專注于利用生物工具CRISPR / Cas9系統開發專有的潛在治療藥物。作為Editas Medicine最強大的競爭對手，Intellia獲得了CRISPR先驅之一的女科學家Jennifer Doudna授權的相關知識產權。

　　Caribou Biosciences

　　“將科學專業知識與誠信、質量體系相結合，提供滿足或超越客戶期望的有益安全產品”

　　位于美國加利福尼亞州的Caribou Biosciences是一家專注基因工程的生物技術公司，開發細胞工程和分析的尖端解決方案。公司的CRISPR-Cas9技術平臺將CRISPR系統作為原核適應性免疫的一種形式，入侵噬菌體、質粒。當Cas9與引導RNA配對時，可以切割雙鏈DNA，從而對DNA進行特異性的改變。這些位點特異性DNA修飾可用于進行復雜的基因敲除。

　　Caribou利用CRISPR-Cas基因編輯技術正在轉化生物研究，開發新的生物基產品。公司的研究平臺有能力在不同的細分市場生產變革性藥物。2014年，Caribou共同創立了Intellia Therapeutics公司，這家新成立的公司利用Caribou的CRISPR-Cas9技術平臺開發基因治療藥物。

　　Agenovir

　　Agenovir主要依靠斯坦福大學科研團隊和聯合創始人Stephen Quake的學術基礎進行技術開發，該公司計劃使用包括CRISPR/Cas9在內的計算工程核酸酶破壞胞內病毒DNA預防感染以及接觸胞內病毒的逆轉錄。該公司隸屬于強生JLabs @SSF生物技術孵化器。

　　前斯坦福大學博士后，清華大學王建斌以及香港科技大學的Angela Wu同時也是Agenovir的合伙人。

　　Editas Medicine

　　成立于2013年9月，總部位于美國馬薩諸塞州坎布里奇市，是一家生物醫藥行業的明星公司，專注于開發精準基因編輯和治療致命性遺傳病的技術。5名創始人均出自美國名校，他們是張峰、Jennifer A. Doudna、George Church、J. Keith Joung和David R. Liu。值得指出的是，張峰和Jennifer A. Doudna是CRISPR技術的發明人，因為，Editas Medicine也當仁不讓的成為基因編輯技術先驅。

　　2016年1月4日，Editas Medicine向美國證券交易委員會（SEC）提交了IPO申請，準備在納斯達克上市，發行價16-18美元，股票代碼為EDIT。2月3日，EDIT作為美國2016年的第一宗IPO正式登陸納斯達克，從而成為基因編輯“第一股”。