量化成像流式細胞技術在心血管研究中的應用

我國每5個成年人中就有1個心血管病患者，每10秒鐘就有1人死于心血管疾病“，心血管疾病在致中國城鎮與農村居民死亡疾病中占首位。因此可見，心血管疾病的預防與治療是未來臨床與科研重點關注的研究方向。轉化醫學這一概念的提出促進了臨床實踐向基礎研究提出新的命題，基礎研究提出可能的解決方案進行臨床驗證，相互轉化。目前中國轉化醫學的研究重點在心血管疾病與腫瘤，集中在疾病的發病機制、疾病的早期非創傷性診斷、疾病的規范治療及新藥物新技術的開發等。細胞水平建立體外疾病模型從而研究相關發病機制與治療手段，是心血管疾病關注的重要方向。流式細胞檢測和顯微成像，是細胞水平研究的兩大傳統方法。利用流式細胞技術，科研人員可以分析上萬個細胞，獲得每個細胞的相對大小、顆粒度和熒光信號的數值，從而得到細胞群體的各種統計數據，篩選出稀有的細胞亞群。但是傳統流式細胞檢測技術存在一定局限，獲得高通量的同時忽略了細胞承載的豐富信息。研究人員僅僅得到散點圖上的一個點，而不是真實的細胞圖像，缺乏細胞形態、亞細胞器結構與熒光信號空間分布的相關信息。要想獲得基于細胞圖像的數據，研究人員必須借助各種顯微成像設備進行觀察，但顯微鏡能夠觀察到的細胞數量是非常有限的，容易遺漏稀少事件，手動分析數據耗費大量人力和時間，而且受實驗人員的主觀因素影響，實驗結果的穩定性很差，難以提供準確的細胞群體量化與統計數據。因此，量化成像流式細胞技術（ImageStream）的出現結合了流式檢測的高通量與熒光顯微鏡的高內涵，同時提供細胞圖像與群體統計數據，給傳統細胞分析帶來了重大變革，在流式細胞分析、分選的傳統技術之外開創了“成像流式“下一代專家級流式細胞技術的發展方向。

心腦血管研究經常涉及分離分析原位組織中的干細胞、前體細胞等，若僅僅使用傳統流式分析方法，難以精確鑒定細胞。熒光顯微鏡又受通量的限制，難以捕獲稀有現象。量化成像流式細胞技術的優勢在于高功率激光器與785nm SSC專用激光器適合分析低含量細胞，結合了量化成像高內涵與傳統流式分析的高通量特點，準確顯示稀有細胞的形態學特性，并可進一步結合細胞表面與內部標記物確認該細胞群生物學功能。極小胚胎樣干細胞（VSELs）是指人類血液及骨髓中存在的一類體積非常小、數量非常稀少的多能干細胞，被認為具有替代胚胎干細胞的潛力，其在科學界深受重視。然而，這種細胞真的存在嗎？來自肯塔基大學的一個心血管疾病研究小組利用ImageStream發現了心肌缺血患者VSELs遷移到外周血的證據（圖一），骨髓中這群細胞的比例僅為0.01%，表達CXCR4+、SSEA+、Oct4+和Nanog+。研究人員精確地了解到VSELs的直徑約為3.6微米左右，而造血干細胞HSC的直徑較大些，大約為6.5微米。對于核/質比的分析發現，VSELs的核/質比顯著高于HSCs，細胞質區顯著小于HSCs。組織器官受損時（如該研究證實的心肌梗死），VSELs可能從骨髓中釋放入血液循環中，以參與損傷修復過程。而受損組織炎性因子或趨化因子的釋放，也會影響VSELs向損傷區域或其他臟器的歸巢。與此類似，ImageStream可應用與心肌組織干細胞研究，結合高通量與形態精確鑒定，研究信號通路的活化。

圖一：心肌萎縮病人的極小胚胎樣干細胞VSELs遷移到外周血中。Lin/CD45為造血干細胞HSCs的標記物，Oct4和CD34為極小胚胎樣干細胞VSELs的標志物，7-AAD標記細胞核，該研究使用了ImageStream系統檢測VSELs，顯示了明場圖像與biomarker的熒光成像，發現Oct4可以與細胞核共定位。來源：Evidence of Mobilization of Pluripotent Stem Cells into Peripheral Blood ofPatients with Myocardial Ischemia.Exp Hematol. 2010 Dec; 38(12): 1131–1142.e1.

細胞自噬是一種利用溶酶體對自身細胞器進行分解、將產生的大分子物質予以回收利用的高度保守的細胞降解過程。饑餓、缺血、氧化應激等均可誘導其發生。自噬的調節也與心血管疾病相關，包括心臟肥大、缺血性心臟病、心力衰竭以及缺血-再灌注損傷。正常的細胞自噬對心肌細胞有保護作用,自噬不足或自噬過度則可促發疾病或加重病變。量化成像分析技術可以（1）借助多種細胞表面與內部標記物追蹤自噬蛋白與自噬小體的變化，（2）統計自噬蛋白與溶酶體的共定位，（3）研究自噬蛋白與受體的相互作用，并可組合多種應用模塊量化分析（4）細胞自噬與凋亡的關系、涉及的上下游信號分子。ImageStream技術在自噬方面的研究成果已有多篇發表于Science、Oncogene、Autophage、Journal of Immunology等高水平專業雜志。

ImageStream技術建立在傳統的流式細胞術基礎之上，結合了熒光顯微成像技術，它具有12個檢測通道，可以對流動中的每個細胞進行成像，并實現了對細胞圖像各種形態學參數量化分析，獲得全新的細胞形態統計學數據。ImageStream技術與傳統流式細胞儀很類似，其系統平臺也是由液流系統，光學系統和檢測系統三大部分組成。液流系統通過注射泵將樣本細胞懸液和系統鞘液注入流動室中，細胞在鞘液流的約束下聚焦在液流的中心，逐個流過檢測窗口。光學系統中光源照射通過檢測窗口的細胞，從而產生光信號。光源分為兩種，其一用于產生明場細胞圖像，另一種是用于產生熒光細胞圖像的激光器。獨特、定制的全固態激光器，功率高且可調節，有利于同時檢測多種熒光信號或是微弱信號。本系統擁有一個獨特的785 nm激光器，用于檢測側向角（SSC）參數，極大提高了該參數的檢測靈敏度。光源照射細胞產生的光信號被大數值孔徑的物鏡收集，然后通過光路系統傳遞到由二向色鏡構成的濾光片堆棧。光信號在這里被分成不同波段投射到CCD的相應檢測通道上，產生明場細胞圖像、暗場細胞圖像和多個熒光通道的細胞圖像，即每個細胞可以獲取12副不同成像。ImageStream技術的檢測系統十分獨特，采用不是傳統流式細胞儀的PMT檢測方式，而是基于時間延遲積分技術的CCD（TDI (time delay integration) CCD）采集，保證了系統對高速運動的流體細胞也能采集高質量圖像。

圖二：系統性紅斑狼瘡SLE病人與正常人群相比，免疫細胞自噬程度增高。綠色熒光標記LC3自噬蛋白，在High高自噬情況下，LC3發生聚集。CD19、CD4、CD14分別標記B細胞、T細胞和單核細胞。來源：Autophagy is activated in systemic lupuserythematosus and required for plasmablast development.Ann Rheum Dis. 2015 May; 74(5): 912–920.

ImageStream系統配有功能強大的數據分析軟件IDEAS?， 可以對每個細胞的圖形進行超過100種量化參數分析。這些參數不僅包括細胞整體的散射光和熒光信號強度，還包括對細胞形態，細胞結構及亞細胞信號分布的分析。點擊散點圖上的點，就可以直觀的看到這個點代表的細胞的圖像。目前已經廣泛應用于細胞信號轉導、細胞共定位、細胞形態變化、胞間相互作用、細胞自噬等典型應用，從而提高了軟件的易用性。另外，使用者還能夠根據自身研究的特殊需要，自定義參數的設定，進行更深入的分析。因而，科學家們既可以將其應用于基礎生命科學研究，如免疫學、生物化學、轉錄組學等等，又可以用于深入了解某些疾病的發病機制。從2005年至今，利用量化成像流式細胞技術已經發表了超過500篇的同行評議文章，其中已有多篇文章發表在Science、Nature、Immunity等頂尖雜志上，說明該技術已經得到了科研界的廣泛肯定。

隨著ImageStream技術的應用不斷推廣，科學家們已拓展了大量靈活新穎的應用。例如，量化成像流式技術可以識別20nm直徑的微粒，非常適合分析心血管疾病涉及的循環微粒、微囊泡；通過多色標記，檢測血小板聚集，評估血栓形成；量化分析納米靶向藥物是否有效等。相信下一代專家級流式必將助力心血管疾病細化研究。