如何用雙酶切鑒定外源DNA在重組質粒中的插入方向
在基因插入的鄰近末端部位選擇一個單酶切點( B ),在載體上選一個單酶切點( A),用這兩個內切酶分別酶切兩份重組質粒,正、反兩個方向的插入將產生不同大小的 DNA 片段,通過凝膠電泳即可鑒定插入片段方向是否正確.......閱讀全文
重組質粒雙酶切鑒定
既然你的質粒已經提出來了，那么感受態、轉化等因素就不必再考慮了。 你看看雙酶切后載體的位置有幾條帶，如果是兩條，那說明酶切不完全，如果是一條，那說明酶切效率沒問題。 pET28a分子量為5.6k，你的插入片段為500bp，如果你的質粒完全切開，載體和插入片段的摩爾比為1：1，質量比就是5.6
【共享】雙酶切
1、 在雙酶切載體時如果2個酶切位點靠得很近，必須注意酶切順序。因為有的限制性內切酶要求其識別序列的兩端至少保留有若干個堿基才能保證酶的有效切割。有的酶要求識別序列兩端有多個堿基的，則必須先切，否則就可能造成酶切失敗。2、 回收PCR產物：回收的PCR產物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol
雙酶切反應
雙酶切buffer的選擇： 1、U ：Supplied with its own unique reaction buffer that is different from the four standard NEBuffers. Its compatibility with the fou
DNA酶切及鑒定
實驗概要限制酶主要存在原核細胞中。多數來源于細菌，有的來源于藍藻和鏈霉菌，極少數來源于支原體等微生物中，存在原核細胞的限制酶能在特異的識別位點切斷外源DNA，如感染的噬菌體。而宿主細胞內的DNA則因它的一些特異識別位點常常由于其中一個堿基的甲基化被保護起來，從而使此位點不再成為限制酶的底物。限制性內
雙酶切反應酶活性分析及雙酶切建議緩沖液
同步雙酶切是一種省時省力的常用方法。選擇能讓兩種酶同時作用的最佳緩沖液是非常重要的一步。NEB每一種酶都隨酶提供相應的最佳 NEBuffer，以保證100%的酶活性。NEBuffer的組成及內切酶在不同緩沖液中的活性見《內切酶在不同緩沖液里的活性表》及每支酶的說明書。能在最大程度上保證兩種酶活性
雙酶切小技巧
A．任何時候2 種酶的總量不能超過反應體系的1/10體積。B．雙酶切時如果兩種酶反應溫度一致而buffer不同時，可查閱內切酶供應商在目錄后的附錄中提供的各種酶在不同buffer中的活力表（也可以向ebiotrade.com客戶服務部索取），如果有一種buffer能同時使2 種酶的活力都超過70
重組克隆篩選（酶切鑒定）
【實驗目的】1.掌握質粒提取的基本方法的原理；2.學習和掌握限制性內切酶的使用方法。【實驗原理】重組克隆的篩選和鑒定是基因工程中的重要環節之一。不同的克隆載體和相應的宿主系統，其重組克隆的篩選和鑒定方法不盡相同。從理論上說，重組克隆的篩選是排除自身環化的載體、未酶解完全的載體以及非目的DNA片斷插入
雙酶切反應酶活性分析
同步雙酶切是一種省時省力的常用方法。選擇能讓兩種酶同時作用的最佳緩沖液是非常重要的一步。NEB每一種酶都隨酶提供相應的最佳NEBuffer，以保證100%的酶活性。NEBuffer的組成及內切酶在不同緩沖液中的活性見《內切酶在不同緩沖液里的活性表》及每支酶的說明書。能在最大程度上保證兩種酶活性的緩沖
質粒DNA的雙酶切
實驗概要掌握質粒DNA雙酶切的原理和操作方法。實驗原理分子生物學實驗中，基因的重組與分離涉及到一系列的酶促反應。許多種酶在基因克隆實驗中有著廣泛的用途。限制性內切酶是一類能識別雙鏈DNA分子特異性核酸序列的DNA水解酶。多種細菌能合成限制性核酸酶，這是它們保護自己，降解外來DNA分子的重要手段。每一
轉化克隆的篩選和鑒定——酶切鑒定法
利用轉化后宿主菌所獲得的抗菌素抗性性狀篩選出獲得質粒的菌落克隆。再從這些菌落中鑒定出質粒上帶有外源基因插入片斷的克隆菌落。實驗材料重組大腸桿菌試劑、試劑盒LB培養基氨芐青霉素乙醇質粒提取試劑盒限制性內切酶緩沖液甘油硫酸鎂Tris鹽酸瓊脂糖儀器、耗材試管記號筆酒精燈冰箱牙簽旋渦混合器鑷子微量移液取樣器
質粒DNA的提取、酶切與鑒定
1. DNA 瓊脂糖凝膠電泳 ① 瓊脂糖凝膠的制備：稱取0.6g 瓊脂糖，置于三角瓶中，加入50 mL TBE 緩沖液，經沸水浴加熱全部融化后，取出搖勻，此為1.2%的瓊脂糖凝膠。 ② 膠板的制備：取橡皮膏（寬約1cm）將有機玻璃板的邊緣封好，水平放置，將樣品槽板垂直立在玻璃板表面。將冷卻至65℃左
如何用雙酶切鑒定外源DNA在重組質粒中的插入方向
在基因插入的鄰近末端部位選擇一個單酶切點( B ),在載體上選一個單酶切點( A),用這兩個內切酶分別酶切兩份重組質粒,正、反兩個方向的插入將產生不同大小的 DNA 片段,通過凝膠電泳即可鑒定插入片段方向是否正確.
雙酶切，兩個酶溫度不同怎么辦
如果能夠找到讓兩種酶同時作用的最佳緩沖液NEBuffer，那就可以同時雙酶切。如果找不到就只能采用分步酶切。分步酶切應從反應要求鹽濃度低的酶開始，酶切完畢后再調整鹽濃度直至滿足第二種酶的要求，然后加入第二種酶完成雙酶切反應。
雙酶切連接反應之全攻略
前一陣子一直在做雙酶切質粒重組，失敗了 很多次，不過很快改善了 實驗方法，用2周重組了 14個質粒。現就自己的體會，結合丁香園戰友的寶貴經驗，談一下質粒重組的一些個人經驗。1、回收PCR產物：在進行PCR擴增時候，給引物兩端設計好酶切位點，一般說來，限制酶的 選擇非常重要，盡量選擇粘端酶切和 那些酶
雙酶切連接反應之全攻略
在進行PCR擴增時候，給引物兩端設計好酶切位點，一般說來，限制酶的 選擇非常重要，盡量選擇粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如BamHI、HindIII，提前看好各公司的雙切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。選好酶切位點后，在各個酶的兩邊加上保護堿基，其原則可
挑克隆鑒定時PCR有目的條帶但是酶切沒有
可能原因：1.PCR擴增的是假克隆，因為PCR驗證的可靠性不穩定。2.質粒中酶切位點變異你可以做如下實驗：1.看重組質粒的大小是不是比原始質粒大2.用提出的質粒做pcr，這樣比較可靠，用細菌做pcr的假陽性極高3.用別的酶再試一下，是否能切出目的片段。
DNA酶切
一、 DNA酶切反應? 1、 將清潔干燥并經滅菌的eppendorf管(最好0.5ml)編號,用微量移液槍分別加入DNA 1μg和相應的限制性內切酶反應10×緩沖液2μl,再加入重蒸水使總體積為19μl,將管內溶液混勻后加入1μl酶液,用手指輕彈管壁使溶液混勻,也可用微量離心機甩一下,使溶
DNA酶切
一、 DNA酶切反應? 1、 將清潔干燥并經滅菌的eppendorf管(最好0.5ml)編號,用微量移液槍分別加入DNA 1μg和相應的限制性內切酶反應10×緩沖液2μl,再加入重蒸水使總體積為19μl,將管內溶液混勻后加入1μl酶液,用手指輕彈管壁使溶液混勻,也可用微量離心機甩一下,使溶液集中在
DNA的酶切與連接——質粒DNA酶切
DNA的連接和酶切可用于：（1）利用限制性核酸內切酶切割DNA和利用DNA連接酶連接DNA是DNA重組過程中的關鍵步驟之一；（2）成功的酶切和有效的連接為后續的外源基因進入宿主細胞進行表達提供了有效的實驗材料。實驗方法原理限制性內切酶能夠特異性地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附
質粒DNA的酶切和瓊脂糖凝膠電泳鑒定
[實驗原理]限制性內切酶識別短的DNA序列并在識別序列內或旁側特異性切割雙鏈DNA。對環狀DNA有多少切口，就能產生多少個酶解片段，因此鑒定酶切后的片段在電泳凝膠中的區帶數，就可以推斷酶切口的數目，從片段的遷移率可以大致判斷酶切片段大小的差別。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。D
快速細胞破碎法實驗步驟和轉化子DNA的酶切鑒定
快速細胞破碎法實驗步驟1、 挑取轉化平板上的單菌接種于含相應抗生素的2ml LB中，37℃振蕩培養至A590值為0.6～0.8。2、 取1ml菌液至1.5ml Eppendorf管中，9000rpm離心9min，去盡上清。3、 加入70μl Cracking Gel緩沖液[1mol/L Tris –
切刻內切酶（NEAR）恒溫擴增
切刻內切酶（NEAR）恒溫擴增是目前相關研究最少的一種恒溫核酸擴增技術。它是在2008年由Ionian科技公司的研究人員開發并申請ZL的（Brain等2009）。除了鏈置換酶（Bst）外，NEAR反應中還需添加一個切刻內切酶。NEAR反應的引物設計需要將所使用的切刻內切酶的DNA作為序列加在引物
DNA酶切反應
一、 DNA 酶切反應1、將清潔干燥并經滅菌的eppendorf管(最好0.5ml)編號，用微量移液槍分別加入DNA 1μg和相應的限制性內切酶反應10×緩沖液2μl，再加入重蒸水使總體積為19μl，將管內溶液混勻后加入1μl酶液，用手指輕彈管壁使溶液混勻，也可用微量離心機甩一下，使溶液集中在管
酶切反應心得
一、 建立一個標準的酶切反應目前大多數研究者遵循一條規則，即10個單位的內切酶可以切割1μg不同來源和純度的DNA。通常，一個50μl的反應體系中，1μl的酶在1X NEBuffer終濃度及相應溫度條件下反應1小時即可降解1μg已純化好的DNA。如果加入更多的酶，則可相應縮短反應時間；如果減少酶的用
內切酶列表：
Single letter code:R = G or A;?Y = C or T;?W = A or T;?M = A or C;?K = G or T;?S = C or G;H = A, C or T;V = A, C or G;B = C, G or T;D = A, G or T;N =
酶切反應建議
一、 建立一個標準的酶切反應目前大多數研究者遵循一條規則，即10個單位的內切酶可以切割1μg不同來源和純度的DNA。通常，一個50μl的反應體系中，1μl的酶在1X NEBuffer終濃度及相應溫度條件下反應1小時即可降解1μg已純化好的DNA。如果加入更多的酶，則可相應縮短反應時間；如果減少酶
限制性內切酶酶切反應實驗原理
限制性內切酶已有百余種，每種酶有其特定的核苷酸序列識別特異性，酶的活性需Mg2+來激活。不同的酶也有許多差別：有些酶除需Mg2+外，還需ATP等其他輔助因子的激活；切割位點和識別序列間的距離不同；某些內切酶同時具有甲基化作用。根據這些差別，可將限制性內切酶分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅱ型限制性內切酶只需要
DNA的限制性內切酶酶切反應
[實驗目的] 通過本實驗學習DNA的限制性內切酶酶切反應的基本原理與實驗技術。 [實驗原理] 1.限制性內切酶能特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA 序列之內或其附近的特異位點上,并切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質分子中兼有切割和修飾(甲基化)作
酶切的基礎知識（酶切原理和實驗過程）
酶切的原理：DNA酶切一般分為質粒直接酶切和PCR產物酶切。限制性內切酶能特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上，并切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類。Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP的存在。Ⅰ類酶結合于識別位點
DNA的限制性內切酶酶切反應技術
限制性核酸內切酶(restriction endonuclease)是指識別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內切核酸酶。本實驗是掌握DNA的限制性內切酶的酶切技術。DNA的限制性內切酶酶切反應技術[實驗原理]1. 限制性內切酶能特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA 序列之內或其附近的特異位