慢病毒轉染貼壁細胞實驗方法
1、慢病毒轉染前18-24小時,將貼壁細胞以1×105/孔鋪到24孔板中。使細胞在慢病毒轉染時的數量為2×105/孔左右。 2、第二天,用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鮮培養基替換原培養基,加入適量病毒懸液。37℃孵育。 3、(對polybrene毒性敏感的細胞選作此步驟)4小時后加入2ml新鮮培養基以稀釋polybrene。 4、繼續培養24小時,用新鮮培養基替換含有病毒的培養基。 5、繼續培養。如果慢病毒含有熒光蛋白,一般轉染48小時后可見明顯熒光表達,72小時后更加明顯。如需FACS檢測轉染效率,可在轉染后72-96小時進行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加藥篩選,可以在轉染3-4天后開始加藥。 注意: 1,病毒感染細胞本來效率就較低,感染時的培養基盡量少些; 2,可使用病毒感染增強劑Envirus代替polybrene,可有效提高病毒的感染效率。......閱讀全文
慢病毒轉染貼壁細胞實驗方法
1、 慢病毒轉染前18-24小時,將貼壁細胞以1×105/孔鋪到24孔板中。使細胞在慢病毒轉染時的數量為2×105/孔左右。 2、第二天,用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鮮培養基替換原培養基,加入適量病毒懸液。37℃孵育。 3、(對polybrene毒性敏感的細胞選作此步驟
慢病毒轉染貼壁細胞實驗方法
1、慢病毒轉染前18-24小時,將貼壁細胞以1×105/孔鋪到24孔板中。使細胞在慢病毒轉染時的數量為2×105/孔左右。 2、第二天,用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鮮培養基替換原培養基,加入適量病毒懸液。37℃孵育。 3、(對polybrene毒性敏感的細胞選作此步驟)
慢病毒轉染肝細胞方法
Lentivirus Transduction of Hematopoietic CellsMing-Jie Li and John J. RossiDivision of Molecular Biology, Beckman Research Institute of the City of Ho
慢病毒轉染細胞步驟
一、慢病毒 ?轉染貼壁細胞實驗方法 1、慢病毒轉染前18-24小時,將貼壁細胞 ?以1×10^5/孔鋪到24孔板中。使細胞在慢病毒轉染時的數量為2×10^5/孔左右。 2、第二天,用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鮮培養基 ?替換原培養基,加入適量病毒懸液。37℃孵育。
慢病毒轉染細胞步驟
一、慢病毒轉染 貼壁細胞實驗方法1、慢病毒轉染 前18-24小時,將貼壁細胞以1×10^5/孔鋪到24孔板中。使細胞在慢病毒轉染時的數量為2×10^5/孔左右。2、第二天,用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鮮培養基替換原培養基,加入適量病毒懸液。37℃孵育。3、(對polybrene
慢病毒轉染懸浮細胞實驗方法和注意點介紹
1、在2×105/ml懸浮細胞中加入polybrene至6 μg/ml和適量病毒,充分混勻。37℃孵育。或者150g室溫離心4小時(選作,部分難轉染的細胞系采用此步驟可以提高轉染效率)。 2、(對polybrene毒性敏感的細胞選作此步驟)4小時后(或離心結束后)加入等體積新鮮培養基以稀釋po
慢病毒轉染細胞的操作步驟
相關專題慢病毒包裝技術專題一、慢病毒 轉染貼壁細胞實驗方法1、慢病毒轉染前18-24小時,將貼壁細胞 以1×10^5/孔鋪到24孔板中。使細胞在慢病毒轉染時的數量為2×10^5/孔左右。2、第二天,用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鮮培養基 替換原培養基,加入適量病毒懸液。37℃孵育
慢病毒轉染細胞的操作步驟
相關專題慢病毒包裝技術專題一、慢病毒 轉染貼壁細胞實驗方法1、慢病毒轉染前18-24小時,將貼壁細胞 以1×10^5/孔鋪到24孔板中。使細胞在慢病毒轉染時的數量為2×10^5/孔左右。2、第二天,用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鮮培養基 替換原培養基,加入適量病毒懸液。37℃孵育
慢病毒包裝實驗
慢病毒包裝實驗 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 慢病毒是反轉錄病毒的一種,具有反轉錄病毒的基本結構和特性:整合入宿主細胞基因組,長期表達,可用于轉基因動物制備;但也有不同于反轉
慢病毒實驗程序
含有目的基因的慢病毒 RNAi 干擾載體的構建和質粒純化,提取慢病毒載體,包裝系統共轉染病毒包裝細胞293T等。 3) 培養 48hrs - 72hrs 左右,收集含有病毒的上清培養液。 4) 病毒的純化和濃縮。 5) 分裝、- 80 ℃保存。 6) 滴度測定目的基因檢定,并出具檢測報告。
慢病毒包裝實驗
實驗材料 病毒試劑、試劑盒 無血清培養基脂質體胰酶含血清的培養基DMEM儀器、耗材 EP管6孔板CO2培養箱高速離心機-80°C冰箱實驗步驟 以六孔板中的1孔為例,每個樣品需要1×106個293T細胞。?1. 取1.5ml滅菌EP管,加入1.5μg包裝混合質粒和0.5μg表達質粒以及250μl的無血
慢病毒包裝實驗
慢病毒載體包裝之后成為假病毒顆粒后,可用于:(1)感染原代培養細胞;(2)制備穩定表達/沉默特定基因的單克隆細胞株;(3)in vivo的基因操作、轉基因動物,特別是轉基因大鼠的制備。實驗方法原理慢病毒是反轉錄病毒的一種,具有反轉錄病毒的基本結構和特性:整合入宿主細胞基因組,長期表達,可用于轉基因動
慢病毒轉染懸浮細胞效率低怎么辦?
懸浮細胞是一類生長不依賴支持物表面,在培養液中呈懸浮狀態生長的細胞。與貼壁細胞相比,懸浮細胞難培養,易死亡,且不易轉染。對于這類難感染的細胞通常我們會優先選擇病毒載體,而慢病毒載體具有可感染分裂與非分裂期細胞,表達時間長等優點,并已作為細胞治療的理想載體得到廣泛應用。然而,慢病毒感染懸浮細胞仍然會存
新型電穿孔方法可溫和轉染貼壁細胞
電穿孔是一種成熟的方法,可將外源分子導入培養細胞中。這個過程大家都很熟悉,是將一系列電脈沖施加在細胞上,導致細胞膜上形成非常小的孔,這樣核酸、蛋白質和藥物等分子就能進入細胞。 傳統的電穿孔是利用大的扁平電極,將高電場施加到培養基中的細胞。然而,如果孔徑太大或時間太長,可能造成相當一部分的細胞死
貼壁細胞的脂質體轉染
一、實驗材料1、宿主細胞CHO(貼壁細胞)2、脂質體LIPOFECTAMINE 2000(invitrogen公司)3、6孔細胞培養版4、無血清培養基OPTI-MEM(GIBICO)5、轉染級質粒二、實驗步驟invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000說明書上列舉了24孔、12孔、6孔
基因轉染技術的病毒方法轉染介紹
病毒作為基因轉染是基因遞送良好的工具,病毒載體的優點有: (1)在轉化的細胞中傳播重組的DNA分子作為穩定的遺傳成分; (2)可能將有缺陷的或突變的基因置于病毒調節信號的控制下以進行研究; (3)能將克隆的基因作為病毒微染色體的一部分 ,并能進行分離; (4)轉移效率較高。其主要缺點是病
關于慢病毒的相關實驗介紹
一、實驗目的 對于一些按常規方法難以轉染甚至無法轉染的細胞,通過病毒介導的實驗能夠大大提高基因的轉導效率,以達到目的基因的高效瞬時表達。 二、實驗流程 1. 根據目的基因相關信息(序列,序列號等),構建含有外源基因或siRNA的重組載體; 2. 對于測序正確的重組質粒,提取和純化高質量的
六大病毒載體技術的比較;不同基因傳遞方法的比較-一
病毒載體經典的病毒載體主要有四類,腺病毒,腺相關病毒,逆轉錄病毒和慢病毒。他們具備侵染細胞譜廣,效率高等特點并廣為研究人員熟知。它們的特點總結歸納如表一。表一:六大病毒載體技術的比較?載體感染廣譜性靶細胞類型表達形式表達時間免疫原性外源片段容量(Kb)滴度(TU/ml)缺點腺病毒載體高分裂和非分裂非
高滴定度慢病毒載體產物實驗
基本方案 高滴定度 HIV-I 基本載體轉染 293T 細胞實驗步驟 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 293T細胞
高滴定度慢病毒載體產物實驗
基本方案 高滴定度 HIV-I 基本載體轉染 293T 細胞實驗步驟實驗材料293T細胞 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?試劑、試劑盒杜氏改良培養基 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
高滴定度慢病毒載體產物實驗
實驗材料293T細胞試劑、試劑盒杜氏改良培養基TE 緩沖液CaCl22 X HeBSPBS漂白劑儀器、耗材乙醇噴壺組織培養皿培養箱滅菌離心管過濾器組織培養瓶實驗步驟展開
慢病毒感染目的細胞實驗步驟
1. 感染預實驗以 24 孔培養板為例,同時進行目的細胞和工具細胞的感染預實驗。工具細胞可選擇 293T(人胚腎上皮細胞)、H1299(人肺癌細胞)或其它細胞。實驗材料:培養基、24 孔培養板,移液槍,槍頭, EP 管,細胞計數板、冰盒、廢液缸等。(根據目的細胞情況,可酌情使用 Polybrene)
懸浮細胞病毒轉染鋪6孔板要多少細胞
懸浮細胞病毒轉染鋪6孔板要多少細胞1、慢病毒轉染前18-24小時,將貼壁細胞以1×10^5/孔鋪到24孔板中。使細胞在慢病毒轉染時的數量為2×10^5/孔左右。2、第二天,用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鮮培養基替換原培養基,加入適量病毒懸液。37℃孵育。3、(對polybrene
慢病毒大規模生產面臨的挑戰
慢病毒作為基因載體在治療各類遺傳性和后天性的人類疾病中倍受歡迎。從基礎研究發展到臨床階段,高濃度純化的載體需求量越來越大,相應的方法也層出不窮。目前大多數慢病毒的生產是在方瓶、平皿等體系中加入胎牛血清貼壁培養HEK293細胞系(293T和293E),通過多質粒瞬時轉染包裝得到病毒,但是該方法難以
病毒包裝技術——慢病毒載體構建及包裝流程
一、實驗流程(1和2為并列步驟)慢病毒過表達質粒載體的構建設計上下游特異性擴增引物,同時引入酶切位點,PCR(采用高保真KOD酶,3K內突變率為0%)從模板中(CDNA質粒或者文庫)調取目的基因CDS區(coding sequence)連入T載體。將CDS區從T載體上切下,裝入慢病毒過表達質粒載體。
慢病毒制備步驟及注意事項
慢病毒包裝技術專題 現今常用的制備慢病毒載體 ?的方法為使用3或者4質粒系統轉染293T細胞。此外,也有使用其它幾類慢病毒包裝細胞系制備慢病毒載體。 瞬時轉染制備慢病毒 ?: 細胞:慢病毒包裝常用人胚腎細胞(HEK, human embryonic kidney)293 ?T,其含有SV4
什么是慢病毒
慢病毒(LV)慢病毒載體(lentivirus vector,LV)屬于逆轉錄病毒科(Retrovidae),為 RNA病毒。區別一般的逆轉錄病毒載體,它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。慢病毒載體的研究發展得很快,研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上,從而達到持久性表
細胞轉染:脂質體轉染的幾個實驗方法
實驗原理 脂質 體(LR)試劑是陽離子脂質體DOTMA和DOPE的混合物(1:1)。它適用于把DNA 轉染入懸浮或貼壁培養細胞中,是目前條件下最方面的轉染方法之一。轉染率高,優于磷酸鈣法,比它高5-100倍,能把DNA和RNA轉染到各種細胞。用LR進行轉染時,首先需要優化轉染條件,應找出該批LR對轉
:六大病毒載體技術的比較;不同基因傳遞方法的比較
病毒載體 經典的病毒載體主要有四類,腺病毒,腺相關病毒,逆轉錄病毒和慢病毒。他們具備侵染細胞譜廣,效率高等特點并廣為研究人員熟知。它們的特點總結歸納如表一。 表一:六大病毒載體技術的比較 載體 感染廣譜性 靶細胞類型 表達形式 表達時間 免疫原
基因轉染技術的非病毒方法運載介紹
1、化學轉染法 (1)DEAE-葡聚糖和polybrene聚陽離子法:帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體復合物和帶負電的DNA分子使得DNA可以結合在細胞表面。通過使用DMSO或甘油獲得的滲透休克將DNA復合體導入。DEAE-葡聚糖僅限于瞬時轉染。 (2)磷酸鈣共沉淀法 :將