核酸探針按性質劃分可分為基因組 DNA 探針、cDNA 探針、RNA 探針和人工合成的寡核苷酸探針等幾類。
作為診斷試劑,較常使用的是基因組 DNA 探針和 cDNA 探針。其中,前者的應用最為廣泛,它的制備可通過酶切或聚合酶鏈反應(PCR)從基因組中獲得特異的 DNA 后將其克隆到質粒或噬菌體載體中,隨著質粒的復制或噬菌體的增殖而獲得大量高純度的 DNA 探針。將 RNA 進行逆轉錄,所獲得的產物即為 cDNA。cDNA 探針適用于 RNA 病毒的檢測。cDNA 探針序列也可克隆到質粒或噬菌體中,以便大量制備。
將信息 RNA(mRNA)標記也可作為核酸分子雜交的探針。但由于來源極不方便,且 RNA 極易被環境中大量存在的核酸酶所降解,操作不便,因此應用較少。
用人工合成的寡聚核苷酸片段作為核酸雜交探針的應用十分廣泛,可根據需要合成相應的序列,可合成僅有幾十個 bp 的探針序列,對于檢測點突變和小段堿基的缺失或插入尤為適用。
核酸探針按標記物劃分可分為放射性標記探針和非放射性標記探針兩大類。放射性標記探針用放射性同位素作為標記物。放射性同位素是最早使用,也是目前應用最廣泛的探針標記物。常用的同位素有32P、3H、35S,其中 32P 的應用最普遍。放射性標記的優點是靈敏度高,可以檢測到皮克級;缺點是易造成放射性污染,同位素半衰期短、不穩定、成本高等。因此,放射性標記的探針不能實現商品化。目前,許多實驗室都致力于發展非放射性標記的探針。
目前應用較多的非放射性標記物是生物素(biotin)和地高辛(digoxigenin)。二者都是半抗原。生物素是一種小分子水溶性維生素,對親和素有獨特的親和力,兩者能形成穩定的復合物,通過連接在親和素或抗生物素蛋白上的顯色物質(如酶、熒光素等)進行檢測。地高辛是一種類固醇半抗原分子,可利用其抗體進行免疫檢測,原理類似于生物素的檢測。地高辛標記核酸探針的檢測靈敏度可與放射性同位素標記的相當,而特異性優于生物素標記,其應用日趨廣泛。