鈣鈣調素對白杄花粉萌發和花粉管生長的調節

實驗概要

本實驗以白杄花粉為實驗材料，用不同濃度鈣調素拮抗劑TFP及外施鈣調素處理培養的花粉，結合熒光標記和免疫抗體標記技術分析游離鈣離子和鈣調素在花粉管中的定位，探討鈣-鈣調素信使系統在花粉萌發和花粉管生長過程中的生理作用。

主要試劑

1.      Ca₂(NO)₃和硼酸：以雙蒸水溶解，配制成100×母液，4℃保存備用。

2.      TFP：購于Sigma，每次稱取少量以雙蒸水溶解，配成5 mg/mL的貯存液，4℃保存備用。

3.      Fluo-3AM：Molecular Probes產品，用無水DMSO溶解配成1mM的溶液，于-20℃下保存。

4.      鈣調素：購自Sigma，溶解配成7.5×10^-2 mol/L的貯存液，-20℃保存備用。

5.      Monoclonal Anti-calmodulin和Anti-mouse IgG-FITC：購自Sigma，于-20℃分裝保存。

6.      100 mM PBS緩沖液(pH 7.4)：分別稱取NaCl 8.0 g， KCl 0.2 g， Na₂HPO₄·12H₂O 2.9 g，KH₂PO₄ 0.2 g，依次溶解于800 ml雙蒸水中，用1 N HCl調pH 7.4，定容至1000 mL。

7.      PME緩沖液：50 mM PIPES，0.5 mM MgCl₂，1 mM EGTA，pH 6.9：分別稱取PIPES 1.512 g，EGTA 0.038 g，MgCl₂ 0.0102 g，用雙蒸水溶解，調pH 6.9，加雙蒸水定容至100 mL。

8.   3%多聚甲醛溶液：0.3 g多聚甲醛，加入8 mL PME緩沖液(pH 6.9)，50-60℃下加熱 30 min，用少量1 N NaOH調pH 6.9，攪拌溶解。然后定容至10 mL。

主要設備

激光共聚焦顯微鏡(ZEISS，LSM 510 META)

光學顯微鏡

搖床

實驗材料

白杄花粉，5月上旬，采集白杄散粉之前的成熟小孢子葉球(雄球果)，置于室溫下干燥48 h，待散粉后用無菌干燥小瓶收集成熟花粉，密封保存于-20℃備用。

實驗步驟

1. 配制含不同濃度TFP的培養基

   1) 12%蔗糖 0.01%H₂BO₃ 0.03% Ca(NO₃)₂ (CKM)

   2) 12%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.03% Ca(NO₃)₂ 1 μM TFP

   3) 12%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.03% Ca(NO₃)₂ 10 μM TFP

   4) 12%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.03% Ca(NO₃)₂ 100 μM TFP

   5) 12%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.03% Ca(NO₃)₂ 1 mM TFP

   6) 12%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.03% Ca(NO₃)₂ 10 μM TFP 0.1 μM CaM

稱取花粉10 mg，室溫下平衡30 min，懸浮于10 mL培養基中，25℃振蕩(120 rpm)暗培養。

 2. 花粉萌發率和花粉管生長速度的測

    1) 花粉萌發率測定：花粉培養約12 h后開始萌發，每隔3 h取樣統計花粉萌發率。當花粉管長度大于花粉粒直徑時，認為花粉萌發。在光學顯微鏡下統計出萌發和未萌發的花粉粒數，根據公式：萌發率＝萌發的花粉數/總的花粉數×100%計算出萌發率。每個實驗重復三次，每次所統計的花粉粒數目不少于300粒。

    2) 花粉管生長速率測定：體外培養12 h后，每隔6 h取少量樣品，用含有與培養基等濃度的蔗糖的3%多聚甲醛溶液固定30 min。在光學顯微鏡下選取已萌發的花粉進行測量。每個實驗至少測定200個花粉管，計算平均長度和標準差。

3. Fluo-3 AM低溫裝載

在不同處理的花粉懸浮液中加入1 mM Fluo-3 AM至終濃度為10 μM，混勻后放于4℃低溫孵育2 h后取出，用CKM洗滌3次，室溫靜置1 h。隨后樣品用多聚賴氨酸(Poly-L-Lys，MW>300 kD，Sigma)粘附在載玻片上，在激光共聚焦顯微鏡(ZEISS，LSM 510 META)下觀察，激發光波長為488 nm，記錄花粉管細胞質中游離Ca² 的分布情況。

4. CaM的免疫熒光抗體標記

花粉管收集后懸浮于3%多聚甲醛中，抽氣固定40 min，PME緩沖液(pH 6.9)洗滌三次，然后用1%纖維素酶和果膠酶混合酶解液于37℃暗處酶解15 min，隨后用PME buffer洗滌三次，1%Triton X-100室溫滲透45 min，PME緩沖液洗滌兩次，PBS緩沖液(pH 7.4)洗一次，加一抗(1：10)室溫孵育2.5 h，PBS洗滌一次后加二抗(1：100)室溫孵育1 h，共聚焦顯微鏡下觀察。