酵母前體mRNA剪接提取物實驗

tRNA UTP RNA 聚合酶

YP Tris-HCl ETDA SDS 甘油 HEPES 鉀鹽 DTT PMSF 磷酸鉀緩沖液 D-山梨醇 SB 緩沖液 等滲液 裂解液 AGK 緩沖液 TBE TE 亞精胺 轉錄緩沖液 NTP ATP 二氯乙酸 乙酸鈉 RNA 洗脫緩沖液 乙酸銨 乙醇 染色液 蛋白酶 K 溶液 乙酸鈉-EDTA 溶液 Tris 堿 平衡酚 過硫酸銨 硅烷化溶液 RNasin

離心機 搖床 Dounce 勻漿器 瓷質研缽 研杵 透析袋 Dewar 燒瓶 防低溫手套 真空濾膜架 電源 玻璃板 聚四氟乙烯梳子和墊片 黃色膠帶 聚丙烯培養試管 Quicksep 柱 臺式振蕩器 旋轉真空濃縮儀

一、材料與設備

1. 剪接提取物制備用溶液

除非另有說明，所有溶液均以蒸餾水制備。

(1) YP：加 20 g 酵母提取物和 40 g 蛋白胨（hacto peptone ) 到 1 L 的去離子水或者蒸餾水中。加 50 g 無水 D-葡萄糖到 70 ml 水中并在加熱盤上攪拌溶解，用水補充至 100 ml 以制備 50% ( m/V ) 的葡萄糖溶液。將 YP 在一帶塞的 2800 ml Fcrnbach 燒瓶或者 4 L 燒瓶中高壓滅菌，50% 葡萄糖存放在帶螺絲帽的瓶中，于室溫儲存。使用前每升 YP 加 40 ml 的 50% 葡萄糖。葡萄糖在高壓火菌后再加入 YP 中，以防止因高壓滅菌過久而焦糖化。

(2) 1 mol/L Tris-HCl ( pH 7.6，pH 7.8 和 pH 8.0）：加 30.29 g Tris 堿到 125 ml 水中，接著加入 92 ml 1 mol/L HCl。用 1 mol/L HCl 滴定調 pH 至 7.6，7.8 或者 8.0，加水至 250 ml。高壓滅菌后室溫保存。

(3) 4 mol/L NaCl，高壓滅菌后室溫保存。

(4) 0.5 mol/L ETDA ( pH 8.0 )：加 18.6 g 的 EDTA ( 二鈉二水合物形式）到 75 ml 的水中溶解 EDTA 并用 10 mol/L NaOH 將 pH 調至 8.0。加水至 100 ml。高壓滅菌后室溫保存。

(5) 10%（m/V）SDS，室溫保存。

(6) 50%（m/V）甘油，高壓滅菌后室溫保存。

(7) 1 mol/L MgCl₂，高壓滅菌后室溫保存。

(8) 2 mol/L KCl，高壓滅菌后室溫保存。

(9) 1 mol/L HEPES 鉀鹽（HEPES-K⁺），23℃ 時 pH 為 7.8：加 119.2 g HEPES 和 20.1 g KOH 到 400 ml 的水中，加水至總體積 500 ml。稀釋一小份樣品到 10 mmol/L，檢測 23°C 時其 pH 是否為 7.5，必要時可用 2 mol/L HCl 調節 pH。在 4℃ 其 pH 應為 7.8。高壓滅菌或者過濾除菌后于 -20℃ 保存。溶液在高壓滅菌后可能有點發黃，但不影響使用。

(10) 1 mol/L DTT：DTT 固體儲存在 -20°C，該溶液保存于 4℃，應該在 24 h 內使用。

(11) 0.5 mol/L PMSF，-20℃ 保存。

(12) 1 mol/L 磷酸鉀緩沖液（pH 7.6）：慢慢將 8.85 g KH₂PO₄ 和 75.75 g K₂HPO₄ 加入到 400 ml 水中，溶解后，其 pH 應該是7.6，然后把總體積調到 500 ml 并高壓滅菌。室溫保存。

(13) 酶解酶溶液 ( zymdyase)：用 20 mmol/L 磷酸鉀、5% 葡萄糖的緩沖液配制 20 mg/ml ( pH 7.6 ) 的酶解酶溶液，用前配制。酶解酶-100T ( 100000 U/g ) 固體于 4°C 儲存。從 1 L 的細胞培養物中制備提取物需 10 mg 的酶解酶。酶解酶不能完全溶解，但不影響使用。

(14) 2 mol/L D-山梨醇：高壓滅菌，室溫保存。

(15) SB 緩沖液：1 mol/L 山梨醇，50 mmoI/L Tris-HCl ( pH 7.8），10 mmol/L MgCl₂，室溫保存。加 1.5 ml 的 1 mol/L DTT 到 50 ml 的 SB 中以制備新鮮的 SB+30 mmol/L DTT。加 0.75 ml 的 1 mol/L DTT 到 250 ml 的 SB 中以制備新鮮的 SB+3 mmol/L DTT。

(16) 等滲液：1 mol/L 山梨醇，以水稀釋 2 mol/L 山梨醇至 1 mol/L。

(17) 裂解液：0.1%（m/V）SDS，50 mmol/L EDTA。

(18) 緩沖液 A：10 mmol/L HEPES-K⁺ ( pH 7.8 )，1.5 mmol/L MgCl₂，20 mol/L KCl，0.5 mmol/L DTT，0.5 mmol/L PMSF。新鮮制備并置于冰上。加 1 ml 的 1 mol/L HEPES-K⁺ ( pH 7.8 )，150 μl 1 mol/L MgCl₂，1 ml 2 mol/L KCl 和 50 μl 1 mol/L DTT 到97 ml 的滅菌水中，僅在使用前才加入 100 μl 0.5 mol/L PMSF。注意 PMSF 在水溶液中的半衰期大約為 30 min。加入 PMSF 時會產生少量沉淀但不影響使用。

(19) 緩沖液 D：20 mmol/L HEPES ( pH 7.8)，0.2 mmol/L EDTA，50 mmol/L KCl，20% 甘油( V/V )，1 mmol DTT，0.5 mmol/L PMSF，從 1 L 細胞培養物中制備提取物，須提前一天準備 2 L 的緩沖液 D。高壓滅菌，置冷室冷卻過夜。在透析前加 1 ml 1 mol/L DTT 和 1 ml 0.5 mol/L PMSF。

(20) AGK 緩沖液：10 mmol/L HEPES-K⁺ ( pH 7.8 )，1.5 mmol/L MgCl₂，200 mmol/L KCl，10% （V/V）甘油，0.5 mmol/L DTT 和 0.5 mmol/L PMSF。使用前才加 PMSF。

2. 體外轉錄和剪接分析用溶液

(1) 10X TBE：890 mmol/L Tris-硼酸，25 mmol/L EDTA（pH 8.3）。室溫保存。

(2) 1X TBE：用蒸餾水或者去離子水稀釋 10XTBE 至 1XTBE，室溫儲存。

(3) 1XTE：10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.6 )，1 mmol/L EDTA。室溫儲存。

(4) 30%（m/V）PEG₈₀₀₀，50℃ 加熱溶解，高壓滅菌，溶液冷卻后分裝為每份 1 ml 和 10 ml，于 -20℃ 儲存。

(5) 1 mol/L 亞精胺：1.27 g 三鹽酸亞精胺（spermidine trihydrochloride ) 溶于 3.5 ml 滅菌水中，用 10 mol/L NaOH 調整 pH 至 7.6，加水到 5 ml。-20℃ 保存。

(6) 10X 轉錄緩沖液：0.4 mol/L Tris-HCl（pH 7.8)，60 mmol/L MgCl₂，40 mmol/L 亞精胺。500 μl 每份儲存于 -20℃。

(7) 0.1 mol/L DTT：用水稀釋 1 mol/L DTT 至 0.1 mol/L，500~750 μl 每份儲存于 -20℃。

(8) 10X NTP：ATP、GTP、CTP 各 5 mmol/L，UTP 1 mmol/L( pH 7.0)，儲存于 -20℃ 使用時 37℃ 水浴迅速解凍并放在冰上。

(9) 100 mmol/L ATP：儲存于 -20℃。使用時 37℃ 水浴迅速解凍并放在冰上。

(10) 二氯乙酸（TCA)：將 500 g TCA 加入 227 ml 的水中制備 100% TCA。在量筒中分別稀釋 10 或 20 倍以制備 10% 和 5% 的 TCA。

(11) 3 mol/L 乙酸鈉（NaAc) ( pH 5.4)：加 40.82 g 的二水乙酸鈉至 75 ml 水中，加冰乙酸調 pH 到 5.4，最后加水至 100 ml。高壓滅菌，室溫保存。

(12) RNA 洗脫緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.6)，0.5 mol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，2% ( V/V ) 苯酚（Tris EDTA 或 NaAc-EDTA 平衡），4°C 保存。

(13) 7.5 moI/L 乙酸銨（NH₄Ac）：用 0.2 μm 孔徑的濾器除菌，4°C 保存。

(14) 70% ( V/V ) 乙醇：室溫儲存。

(15) 染色液：10% 溴酚藍，10% 二甲苯藍，室溫保存。染料可能不完全溶解，但不影響使用，使用前用力搖晃。

(16) 去離子甲酰胺，pH 大于或等于分裝成 1~10 ml 每份，于 -20°C 儲存。儲存超過 6 個月時須檢查其 pH，如果 pH 低于 6.5 需進行去離子處理。

(17) 轉錄產物上樣緩沖液：98% 甲酰胺，50 mmol/L EDTA，溴酚藍和二甲苯藍各 0.1%。-20℃ 儲存。

(18) 蛋白酶 K 溶液：2.5 mg 蛋白酶 K 溶于 1 ml 4% ( m/V) SDS、50 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.8)，0.25 moI/L EDTA 混合物中。1 ml 每份儲存于 -20°C。

(19) tRNA：于 10 ml 的無菌水中溶解 100 mg 的 E.coli tRNA，0.5~1 ml 每份，儲存于 -20℃。

(20) 剪接分析終止緩沖液：混合 200 μl 的 tRNA 和 1 ml 的蛋白酶 K 溶液。0.2~0.5 ml 每份，儲存于 -20℃，使用時在 37℃ 融化并保持在 23~25℃ 以防止使用時 SDS 沉淀。

(21) 剪接分析用上樣緩沖液：0.1X TBE，8 mol/L 尿素，溴酚藍和二甲苯藍均為 0.1%。加 0.22 g 尿素（超純）到 200 μl 無菌水中，65℃ 加熱使尿素溶解。加此尿素溶液 200 μl 至 94 μl 水、3 μl 的 10X TBE 和 3 μl 染色液（10% 溴酚藍，10% 二甲苯藍）中，此緩沖液需當天使用。

(22) 乙酸鈉-EDTA 溶液：300 mmol/L NaAc ( pH 5.4)，50 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaAc ( pH 5.4)，100 mmol/L EDTA。室溫儲存。

(23) 1 mol/L Tris 堿，高壓滅菌后在室溫儲存。

(24) Tris-EDTA 平衡酚，4°C 可儲存 1~2 天，長期儲存應凍存于 -20°C。當有機相變成淡橙色時應棄用。

(25) NaAc-EDTA 平衡酚：65℃ 加熱 500 g 分子生物學級的酚并加入 0.5 g 8-羥基喹啉，然后加入 500 ml 300 mmol/L NaAc ( pH 5.4)、50 mmol/L EDTA 溶液，用攪拌器快速混合 10 min，停止攪拌并讓液體分成水相與有機相，吸棄上層的水相，再加入 100 ml 300 mmol/L 新配制的 NaAc ( pH 5.4) 和 50 mmol/L EDTA，快速攪拌 5 min，靜止使液體分相，并吸棄大部分的上層水相，無機相上層剩余約 2 cm 厚的水相。4℃ 可儲存 1~2 天，長期儲存應凍存于 -20°C。當有機相變成淡橙色時應棄用。

(26) NaAc-EDTA 平衡苯酚：氯仿：異戊醇：加 20 ml 的異戊醇到 480 ml 的三氯甲烷中，然后將該溶液倒入 500 ml 的用 NaAc-EDTA 平衡的苯酚中，快速攪拌約 5 min，使各相分層，儲存方法同 Tris-EDTA 平衡酚。

(27) 氯仿：異戊醇（24 :1 )：在通風櫥中操作并戴手套，倒 240 ml 的氯仿至一 250 ml 玻璃量筒中，加異戊醇使體積達到 250 ml。儲存于帶蓋玻璃瓶里，通風櫥中存放。

(28) 1X TBE、8 mol/L 尿素：加 240.2 g 尿素到 250 ml 溫水和 50 ml 10X TBE 中。低溫加熱攪拌至尿素溶解，將溶液倒入量筒中，冷卻后加水補充至 500 ml，于 4℃ 儲存。若有尿素沉淀于 37℃ 水浴加熱溶液至尿素溶解。

(29) 用 1X TBE、8 mol/L 尿素配制丙烯酰胺[ 29%（m/V）丙烯酰胺，1%（m/V）甲叉雙丙烯酰胺 ]：為得到 5%（m/V）丙烯酰胺溶液，加 12.1 g 丙烯酰胺（電泳級）和 0.4 g 的甲叉雙丙烯酰胺到 250 ml 的 1X TBE、8 mol/L 尿素中，攪拌至丙烯酰胺完全溶解。制備 7.5%( m/V ) 丙烯酰胺溶液，加 18.12 g 的丙烯酰胺（電泳級）和 0.63 g 的甲叉雙丙烯酰胺到 250 ml 的 1XTBE、8 mol/L 尿素中并攪拌至丙烯酰胺完全溶解。兩種丙烯酰胺溶液于 4℃ 在帶螺帽的瓶中可儲存一年。如果儲存期間出現沉淀，在 37℃ 水浴加熱直至沉淀溶解。

(30) 10%( m/V）過硫酸銨（APS ) 和 TEMED，過硫酸銨 4°C 可儲存 1 周；TEMED 儲存于 4℃。

(31) 硅烷化溶液：15%（V/V）二氯二甲硅烷溶解于氯仿中。儲存于磨口玻璃瓶中，于通風櫥中存放。

(32) 2%（m/V）NaHCO₃。

(33) 15%（V/V）甲醇，5%（V/V）乙酸，在帶螺帽的瓶中室溫儲存。

3. 制備提取物用的設備和材料

(1) 搖床：要求能使用大的燒瓶，轉速達 300 r/min 并能維持在 30℃，以培養酵母細胞。

(2) 離心機：具有適當轉子的微型高速臺式（或者臨床用）離心機和超速離心機。

(3) 玻璃或金屬的 Dounce 勻漿器。

(4) 12.7 cm 的瓷質研缽和研杵：初次使用時，用鉻酸溶液處理研缽和研杵 15~30 min，然后用水徹底清洗。在研缽中注滿 AGK 緩沖液，將研杵放入研缽，室溫放置 30 min。最后用滅菌的蒸餾水徹底清洗研缽和研杵并風干。使用時用去離子水清洗，然后用滅菌的蒸餾水清洗并風干。

(5) 透析袋（1.27 cm 寬，截留分子質量>3500 Da）和 4 cm 透析袋夾。實驗前一天按如下步驟處理透析袋：剪成 30 cm 長的條，在 4 L 的 2% 碳酸氫鈉中煮沸 15 min，用大量的滅菌水洗 3 次。在緊密封閉的容器里，處理過的透析袋在 70% 乙醇中于 4℃ 可存放幾年以上。在使用透析袋之前約 15~30 min，從乙醇中取出并擠掉過多的液體，在幾百毫升的滅菌水中浸泡，然后用更多的滅菌水清洗。用 10~12 ml 新鮮的滅菌水沖洗透析袋內側兩次，浸入冷的緩沖液 D 中。

(6) 兩個 350 ml Dewar 燒瓶。

(7) 0.5~10 L 液氮（N₂）。

(8) 防低溫手套。

(9) 一個超低溫（-70~-80℃）冰箱或液氮罐。

4. 體外轉錄和剪接分析用設備和材料

(1) [ α-³²P ] 尿苷三磷酸（UTP)：3000 Ci/mmol 和 10 mCi/ml。

(2) T7 或者 SP6 RNA 聚合酶。

(3) RNasin：40 U/μl。

(4) 支持 24 mm 過濾器的鋼制真空濾膜架。

(5) Whatman 玻璃纖維（GF/C）24 mm 濾紙。

(6) 電源：可維持穩定的高達 1000 V 的電壓和 100 mA 的直流電。

(7) 兩塊玻璃板（4 mm 厚）：一塊尺寸為 19 cm 寬、16 cm 高，另一塊尺寸相同，但有一 2.2 cm 深、16.3 cm 寬的槽。

(8) 聚四氟乙烯梳子和墊片。為純化轉錄物，墊片和梳子應為 1.5 mm 厚，梳子 16 cm 寬、3 cm 高，7 個齒，齒間間隔為 2 mm，每個齒 1.4 cm 高、1.8 cm 寬，每個齒形成的孔最大體積 80 μl。用于剪接分析的梳子和墊片是 0.38 mm 厚，梳子 15.5 cm 寬，2.6 cm 深，14 個齒，齒間間隔為 4 mm，每個齒 8 mm 高、7 mm 寬，每個齒形成的孔可容納 15 μl。

(9) 黃色膠帶。

(10) 一次性帶帽的無菌聚丙烯培養試管（12 mm X 75 mm 或 17 mm X 100 mm）和一次性帶螺帽的無菌刻度圓錐形聚丙烯離心管（50 ml）。

(11) 空的 Quicksep 柱（Empty Quicksep columns）（Isolab、Inc、Akron、OH、USA）。

(12) X 射線片（20.32 cm X 25.4 cm），避光 X 射線片暗盒，增感屏，X 射線片處理設備。

(13) 硅烷化并烤過的玻璃棒、Corex 試管。

(14) 臺式振蕩器。

(15) 旋轉真空濃縮儀（Spced-Vac concentrator）或凍干器。

(16) 3 MM Whatman 濾紙（46 cm X 67 cm）。

(17) 凝膠干燥器（可選）。

二、操作方法

1. 勻漿原生質球獲取整細胞提取物

為盡可能得到有最大活性的提取物，要以最快的速度操作直至透析。

(1) 1 L 的酵母細胞培養物過夜培養到對數生長期的中后期。首先在 125 ml 或者 250 ml 的燒瓶中過夜培養 10~50 ml 酵母，第二天將其轉移到 1 L YPD 中。使培養物在 30℃，以轉速 250~300 r/min 培養過夜，使其密度達到 3X10⁷~5X10⁷/ml。對于酵母菌株 EJ101，30℃ 用 YPD 培養，倍增時間為 90 min。

(2) 收集酵母細胞。在高速離心機中 1200~1500 g 離心 5 min 收集細胞。采用 100 ml 的 SB+3 mmol/L DTT 重懸細胞并再次離心，再采用 30 ml 的 SB+30 mmol/L DTT 重懸細胞沉淀，室溫放置 15 min。在 30 mmol/L DTT 中的孵育對后面的原生質球的形成十分重要。1500 g 離心 5 min，用 30 ml 的 SB+3 mmol/L DTT 重懸細胞并轉入無菌的 120 ml Erlenmeyer 燒瓶。

(3) 酶解酶孵育細胞并監測原牛質球的形成。取 20 μl 兩份細胞，將一份加到 1 ml 的等滲溶液中，另一份加到 1 ml 的裂解液中，通過測 λ₅₀₀ 的光吸收值來監測細胞的裂解。在細胞培養瓶中加入 250 μl 的酶解酶-100T 溶液，30℃ 50~60 r/min 緩緩搖 40 min。每 10~15 min 取出 20 μl 兩份，分別加入 1 ml 的等滲溶液和裂解液中，測 λ₅₀₀ 的吸收值以監測原生質球的形成。當裂解液中的光吸收值為等滲溶液中光吸收值的 20% 或更少時，表明酶解達到要求。

(4) 此前一步操作均需在冷室中進行以保持樣品冷卻。設備（包括吸管、轉子和溶液）均要在冷室中過夜預冷。

(5) 勻漿裂解原生質球。用一無菌硅烷化的玻璃棒輕輕地使原牛質球重懸于冷的緩沖液 A 中，1 L 培養物（4X10⁷~5X10⁷ 細胞/ml）用 8 ml 緩沖液 A。然后將原生質球轉移到一冷的 7 ml 或者 14 ml Dounce 勻漿器中，勻漿器置于冰上勻漿 5~10 次。

(6) 0.2 mol/L 氯化鉀處理勻漿液以從核中釋放剪接因子。勻漿液倒入 15 ml 帶刻度的一次性無菌圓錐離心管中，記下勻漿液的體積。如果在勻漿液中有大量氣泡，用冷卻的臺式離心機短暫離心（2 min）以消除氣泡。勻漿液倒入置于冰上的帶有一個小攪拌子的 25 ml 玻璃燒杯中，緩緩攪動（約 60~120 r/min）10 min。用吸頭慢慢（2 min）加入 0.9 倍體積冷的 2 mol/L KCl 至終濃度為 0.2mol/L，再緩緩攪動 30 min。

(7) 通過兩次離心沉淀細胞碎片和細胞器，將勻漿轉移到 10 ml 或者 30 ml 的螺帽 Oak Ridge 試管并在 4℃ 以 33000 g 離心 30 min 以沉淀大的碎片。在冷室從轉子中取出試管，吸取上淸轉移到一個厚壁聚碳酸酯的帶螺帽試管中，然后于 4℃ 100000 g 離心 1 h。

(8) 透析提取物。把離心機轉子移到冷室中，小心取出試管并放到試管架上，打開蓋子。樣品分為三層：薄的上層包括脂類和脂蛋白；厚的中間層為澄清的淡黃綠色，包括大部分的剪接活性物質和一些核糖體；底層則為清晰的淡棕色，包括細胞器、核糖體和大的細胞碎片。從緩沖液 D 中取出透析袋，戴上手套，擠掉多余的液體，以夾子封閉一端。用冷的無菌巴斯德吸管吸取黃綠色的中間層液體，小心操作，避免吸到上層或底層。提取物吸到透析袋中，約 6~8 ml。擠去袋中的空氣，用夾子在接近提取物的地方夾住透析袋。將透析袋置于一個裝有 1 L 緩沖液 D 和一個無菌磁力攪拌子的無菌燒杯中。將燒杯放在冰槽中，周圍放上冰，冰槽則放在冷室中的磁力攪拌器上。1.5 h 后更換緩沖液 D，共攪拌透析 3 h。提取物更多時可增加緩沖液 D。

(9) 離心去除透析時產生的沉淀。透析后，提取物的量可能減少 1~2 ml，從透析緩沖液中取出透祈袋，用紗布擦去袋外的液體，打開上端的夾子，用一冷的無菌巴斯德吸管吸出提取物轉移到一冷的 Oak Ridge 試管或者幾個冷的微量離心管中。在 4℃ 以 12000~14000 g 時離心 10 min。

(10) 保存提取物。以每管 100 μl，200 μl 或者 500 μl 將提取物分裝到置于冰上的微量離心管或凍存管中。快速冷凍后在液氮或者 -70℃ 冰箱中保存。

(11) 1 L 酵母培養物可得到 6 ml 提取物，每毫升約含蛋白質 20~30 mg。

2. “冷凍斷裂” 法獲得全細胞提取物

(1) 如上所述方法培養酵母細胞。以 1500 g 在 4℃ 離心 10 min 收集細胞。

(2) 準備細胞。將細胞在 50~100 ml 冷的 AGK + PMSF 緩沖液中重新懸浮，在 4℃ 以 1500 g 離心 10 min，從這一步開始樣品要保持冰冷。倒出上清并加入 20 ml 新配制的冷 AGK+ PMSF 緩沖液重懸浮細胞，將細胞懸液轉移至無菌的 50 ml 聚丙烯刻度離心管中。在臺式離心機或者高速離心機里于 4℃ 1500 g 離心 10 min，倒出上淸，細胞沉淀約為 0.5 ml，加入 0.4 倍體積的 AGK+PMSF 緩沖液，以硅烷化并烤過的玻璃棒重懸細胞，懸浮液十分黏稠，將其放置在冰上。

(3) 快速冷凍懸液，用巴斯德吸管將懸浮液滴到液氮中以形成直徑為 0.2~0.5 cm 的小球。在冷凍細胞懸液之前，將研缽和研杵放到空的苯乙烯泡沬冰槽中，把液氮倒入研缽內、外并等其停止劇烈冒泡后，使裝有半研缽液氮的研缽浸入 2 cm 深的液氮中。為了便 于吸取黏稠的細胞懸液，可折斷巴斯德吸管的頂端以使其吸口變大。吸管頂端至少高出液氮表面 5 cm（防止懸液在吸管中冷凍），將懸液滴加入研缽中的液氮里。

(4) 所有的懸液均凍成小球后，磨碎提取物。一手戴隔熱手套握住研缽，輕輕地研磨液氮中凍結的小球以使它們變成小的碎片，然后研磨使之變成粉末。當研缽中的液氮蒸發后，懸液可以被研磨成十分細的粉末，粉末越細提取物的活性越好。研磨時間通常是 20~30 min，即使液氮在研磨的最后階段從研缽中蒸發。要不斷補充液氮到冰槽中使研缽浸在 1~2 cm 深的液氮中。

(5) 把研磨后的細胞粉未轉移到試管中融解。在液氮中冷卻一個小勺，室溫下用它將研磨后的細胞粉未轉移至有螺帽的 Oak Ridge 試管中，使研磨過的懸液在冰上融化，間歇渦旋振蕩試管。

(6) 繼續處理如操作1 “勾漿原生質球獲取整細胞提取物” 中第 (7)~(11) 步所述。

(7) 1 L 細胞培養物可獲得約 3~4 ml 提取物。

3. 提取物的剪接分析

(1) 制備用于剪接分析實驗的放射性標記的前體 mRNA

① 轉錄

A. 40 μl 體外轉錄反應體系得到的轉錄產物可進行 6~10 次剪接分析（10~15 個反應），轉錄產物應在兩周內使用。

B. 制備用于轉錄的 DNA 模板。選用合適的內切酶在 200 μl 反應中酶切 50 μl DNA（約 50~100 μg）以制備線狀 DNA。加入 10 μl 4 mol/L NaCl 將 DNA 溶液中的 NaCl 濃度調整為 0.2 mol/L。分別用 Tris-EDTA平衡酚、氯仿：異戊醇抽提，加入 3 倍體積的無水乙醇使 DNA 沉淀。用 70% 乙醇洗 DNA 沉淀，真空干燥后用 50 μl 的 1X TE 溶解。于 -20°C 保存。

C. 進行轉錄反應。對于一個 40 μl 反應體系，按下列順序在室溫下把下列試劑加到一個微量離心管中：6 μl 無菌水，4 μl 0.1 mol/L DTT，4 μl 10X 轉錄緩沖液，4 μl 10X NTP，4 μl 30% PEG₈₀₀₀，2 μl RNsin，4 μl DNA （1~2 μg），8 μl [ α-³²P ] UTP 和 4 μl T7 RNA 聚合酶。37℃ 溫育 2 h。再加入 2 μl RNA 聚合酶溫育 1 h。

D. 三氯乙酸沉淀法測定放射性同位素的摻入效率。取出 2 μl 反應液并加入 10 μl 的 E.colo tRNA ( 10 mg/ml )，加入 500 μl 的 10% TCA 并在冰上孵育 10 min。然后把小管中的混合物加到真空過濾裝置的玻璃纖維濾膜上，用約 1 ml 的 5% TCA 沖洗試管并將其加到濾器中，先后用 5ml 的 5% TCA 和 5 ml 的 95% 乙醇再清洗濾膜兩次。濾膜干燥后，置于裝有 15 ml 水的閃爍瓶中，用液體閃爍計數器測量放射性強度。好的轉錄反應每 2 μl 應有約 2X10⁶ Cerenkov/min。其余產物 -20℃ 可保存 2 天。

E. 準備電泳的樣品。加等體積（40 μl ) 的上樣緩沖液到反應中，65℃ 加熱 10 min 使 RNA 變性并立即置于冰上。

② 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

A. 淸洗玻璃板和硅烷化帶凹口的玻璃板，使用 1.5 mm 厚的墊片。

B. 灌制凝膠。戴上手套，取 70 ml 的 5% 丙烯酰胺溶液加入燒杯中，加入 TEMED 和 0.45 ml 10% APS 并混勻，將其倒入電泳裝置的玻璃板間的縫隙直到與帶凹口的玻璃板的頂端平齊，操作時避免產生氣泡。插上梳子，將凝膠放在工作臺上至少凝集 1 h。如果當天不用，室溫下凝膠可放在有一濕紙巾的密封袋中保存 1~2 天。

C. 進行凝膠電泳。在電泳槽中注滿 1X TBE。保持電壓恒定，以大約 60~65 mA 電流進行預電泳 20 min，使凝膠玻璃板溫度達到 40~45℃（摸起來相當熱），不要讓它的溫度變得更高，否則玻璃板將會發生斷裂。

D. 上樣并電泳。關掉電源，沖洗上樣孔，然后上樣。以 55~60 mA 電流電泳約 1.5 h，直至溴酚藍泳出凝膠。小心地從下層容器中取出放射性的緩沖液并且按照放射安全程序處理。在上層容器中幾乎沒有放射性，緩沖液倒入水槽。取出墊片并將凝膠玻璃板冷卻到室溫，將兩塊玻璃板分開，凝膠應該附著在無凹口的玻璃板上，以塑料膜包裹凝膠和玻璃板。可以將凝膠-玻璃板在 -20°C 冷凍保存，于 24~48 h 后解凍以完成轉錄產物的處理。

③ 提取和純化轉錄產物

A. 放射自顯影。在暗室里，取一張 X 射線片放在干凈的紙上，將凝膠-玻璃板（凝膠面朝下）放在 X 射線片上曝光 2 min。將暗盒蓋在凝膠上，不要蓋住上樣孔，在離其 4~5 英尺（1 英尺=30.48 cm) 的地方用一小的閃光燈閃 1~2 s，這將使上樣孔的輪廓曝光在 X 射線片上，這可以通過對齊凝膠和 X 射線片上的影像以對轉錄產物進行定位。曝光 2 min 后沖洗 X射線片。

B. 定位并切下有轉錄產物的凝膠帶。將 X 射線片與凝膠-玻璃板（凝膠面朝上）對齊以定位轉錄產物。戴上手套，用干凈的刀片切下目的帶，避免切下多佘的凝膠。從帶上去除包裹的塑料膜，將切出的帶放入一次性聚丙烯管中。

C. 用壓碎浸泡法提取轉錄產物。用無菌硅烷化的玻璃棒將切下的凝膠擠成碎片，然后加入 1.5 ml 的洗脫緩沖液。密封后在 37℃ 搖 4 h（或者 4°C 搖過夜）。室溫下用臺式離心機以最大速度離心 10 min 以沉淀凝膠碎片，吸取上清（包括放射性的轉錄產物）并通過 Quicksep 柱過濾到 15 ml Gorex 試管中。加 1 ml 的新配制的提取緩沖液到擠碎的凝膠中，混合 15~30 min，然后重復離心和過濾過程，這可以回收約 60~80% 的放射性轉錄產物。

D. 用氯仿和苯酚抽提轉錄產物。用兩倍體積 NaAc-EDTA 平衡酚來抽提上清液，室溫下 11420 g 離心 10 min 以分離水相和有機相。將上層的水相轉移到一干凈的 Corex 試管中。用兩倍體積的氯仿：異戊醇再進行抽提，水相轉移至干凈的 Corex 試管中。

E. 沉淀轉錄產物。加 3 倍體積的無水乙醇，并在干冰上孵育 10 min 或者在 -20℃ 過夜。4°C 11420 g 離心 10 min 以沉淀 RNA。沉淀可能不可見，但可以采用蓋格計數器進行檢測。小心倒出上清并加入約 5 ml 70% 乙醇洗沉淀，重復離心然后倒掉上清，真空干燥沉淀。

F. 在乙酸銨和乙醇中再沉淀 RNA 以去除剩余的鹽分并保存轉錄產物。用 400 μl 的無菌水溶解 RNA 沉淀，將溶液轉移至加有 200 μl 7.5 mol/L NH₄Ac 的小離心管中并混合。以每份 200 μl 分裝到 3 個離心管中，并且加入 3 倍體積（600 μl）的無水乙醇再次沉淀 RNA。-20℃ 保存。

G. 每 3~5 天取一管轉錄產物，在微量離心機里于 4°C 離心 10 min 沉淀轉錄產物，750 μl 70% 乙醇洗滌沉淀。室溫下于旋轉真空濃縮儀中干燥，最后溶于 50 μl 的水中，放在冰上。取出 2 μl 的轉錄產物加入裝有 1 ml 水的 1.7 ml 微量離心管里，將其放在無蓋的閃爍瓶中，用閃爍計數器計數。余下的 48 μl 轉錄產物用無菌水稀釋到 20000~40000 Cerenkov cpm/μl，儲存于 -20°C。取用轉錄產物時應放在冰上。

(2) 基本剪接分析

① 剪接分析前先灌制凝膠。按前述方法裝配凝膠玻璃板，采用 0.38 mm 厚墊片和梳子并灌制 7.5% 的丙烯酰胺凝膠。

② 使用前將冷凍的提取物在冰上融化，并且放置在冰上。

③ 在提取物融化的同時，準備剪接反應系統。在冰上按下列順序添加溶液：6.8 μl 水，1.5 μl 1mol/L 磷酸鉀緩沖溶液（pH 7.4)，2.5 μl 30% PEG₈₀₀₀，0.75 μl 的 0.1 mol/L MgCl₂，0.5 μl 100 mmol/L ATP，0.5 μl 100 mmol/L DTT 和 2.5 μl 轉錄產物，然后充分混合。

④ 起始和終止反應。添加 10 μl 的提取物到前面準備的剪接反應系統中起始反應，在 25 μl 反應體系中，各成分的終濃度分別為 60 mmol/L 鉀，3% ( m/V) PEG₈₀₀₀，3 mmol/L MgCl₂，2 mmol/L ATP，20 mmol/L KCl，8 mmol/L HEPES，80 μmol/L EDTA，2.2 mmol/L DTT，8% ( V/V）甘油，0.4 nmol/L 前體 mRNA 和 40~80 μg 提取物。快速混合各組份并置于 23℃ 水浴中。加入提取物 15 min 和 30 min 后分別取出 10 μl 反應液加入 6 μl 終止液（室溫）中。終止后的樣品可在室溫下保持直到剪接反應完成，或在 -20℃ 保存備用。

⑤ 從樣品中提取 RNA。用蛋白酶 K 在37℃ 溫育提取物 30 min 以降解其中的蛋白，加入 200 μl 50 mmoI/L NaAc ( pH 5.4)，10 mmol/L EDTA，然后用 750 μl 的苯酚/氯仿/異戊醇 ( 苯酚以 NaAc-EDTA 平衡）抽提，在水相中加入 3 倍體積（大約 1000 μl）的無水乙醇，干冰上 10 min 或者在 -20℃ 2 h 甚至過夜以沉淀 RNA。

⑥ 準備 RNA 樣品。采用微量離心機于室溫以 12000~14000 g 離心 10 min 沉淀 RNA，小心倒出上清，用 70% 乙醇洗 RNA 沉淀并于室溫下用旋轉真空濃縮儀干燥。用新鮮的剪接分析上樣緩沖液溶解 RNA 沉淀，65°C 加熱樣品 5~7 min，立即置于冰上。

⑦ 上樣并電泳。干燥樣品時，在電泳槽中加入 1X TBE，在 30 mA 和大約 500V（恒壓）的條件下預電泳約 15 min 使凝膠變熱。每孔加 4~6 μl 的樣品并在 25~30 mA 和大約 600V 的條件下開始電泳。由于電流在預電泳時稍有下降，有必要提高電壓使電流維持在 25~30 mA。電泳時間與前體 mRNA、剪接反應產物和中間產物的遷移率，以及聚丙烯酰胺凝膠的濃度有關，這需要通過預實驗來確定。

⑧ 取出凝膠，在室溫下冷卻玻璃板，然后分離玻璃板。凝膠應該留在沒有凹口的玻璃板上。切下稍大于凝膠的一張 Whatman 3 MM 濾紙，放在凝膠上并使凝膠緊緊附著到紙上。將玻璃板反過來，小心取下玻璃板，而凝膠粘在紙上。用塑料保鮮膜包裹凝膠，并在帶增感屏的暗盒中于 -70℃ 曝光 X 射線片 5~8 h。

⑨ 當需要進行多次曝光時，應干燥凝膠以防止 RNA 擴散。將凝膠紙放入 10 倍體積的 15% 甲醇，5% 乙酸中，并在室溫下緩緩搖半小時以沉淀 RNA 并去除凝膠中的尿素。在凝膠干燥器中以 80℃ 干燥凝膠 0.5~1 h。

(3) 評估提取物的活性

一般說來，高活性的酵母提取物在 23℃ 時 30 min 可剪接大約 50% 的放射性標記肌動蛋白前 mRNA，使其成為成熟的 mRNA。