新冠肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)自2019年底爆發以來肆虐全球,嚴重威脅著人們的生命健康和日常生活,也給許多國家的經濟帶來沉重打擊。同時,全球科學家的目光也空前聚焦于新冠病毒(SARS-CoV-2)與新冠肺炎的研究,以期通過科學的力量幫助人類戰勝這一挑戰。目前,為治療丙型肝炎和埃博拉病毒感染研制開發的Remdesivir是唯一經FDA批準的用于治療新冠肺炎的抗病毒藥物。結合2003年的非典(SARS)以及2012年的中東呼吸綜合征(MERS)的爆發來看,冠狀病毒引發的瘟疫呈現出越來越頻繁的趨勢。因此,研制強有力的抗病毒備選藥物對于應對當前疫情以及將來可能發生的冠狀病毒感染來說都是十分重要的。
SARS-CoV-2是一種正鏈RNA病毒,基因組RNA全長約3萬核苷酸,屬于冠狀病毒科,與非典病毒(SARS-CoV)和MERS病毒 (MERS-CoV) 同屬于beta冠狀病毒屬。SARS-CoV-2進入人體細胞后,首先需要對其最長的一個開放讀碼框ORF1ab進行翻譯,生成一個大型融合蛋白。然后,在病毒蛋白水解酶的作用下,融合蛋白被切割成16個病毒復制所需要的酶。實際上,ORF1ab由ORF1a和ORF1b兩部分組成,ORF1b位于ORF1a的?1讀碼框。ORF1ab融合蛋白的翻譯過程中存在一個非常特殊的現象:程序性核糖體?1讀碼框移位(programmed ?1 ribosomal frameshifting,?1PRF)。當翻譯進行到鄰近ORF1a末端時,一部分核糖體會向5′端移動一個核苷酸的位置, 重新定位于?1讀碼框并接著翻譯ORF1b,從而避開ORF1a末尾的終止密碼子。
許多研究表明,這種核糖體移位現象是由病毒RNA的特殊二級結構介導的。在病毒RNA上ORF1a和ORF1b的交接處,存在一個讀碼框移位激活元件(frameshifting stimulatory element,FSE)。FSE主要分兩部分:一個包含7個核苷酸的滑動序列(slippery sequence)和一個由3個莖結構組成的RNA假結(pseudoknot)。在翻譯過程中,pseudoknot使得病毒RNA與配位tRNA之間產生張力,從而使tRNA與核糖體在滑動序列處向上游移動一個核苷酸,重新配位于?1讀碼框。
這種翻譯過程中的核糖體移位決定了ORF1b上諸多基因的表達,對于新冠病毒的復制至關重要。不僅僅局限于新冠病毒,所有冠狀病毒以及另外許多RNA病毒的蛋白質翻譯都需要讀碼框移位的參與。與此相對,這種現象在人類自身基因的表達過程中極為罕見,使其可以作為一個良好的藥物靶點。
近日,耶魯大學醫學院郭俊傑博士團隊等在PNAS上發表文章Restriction of SARS-CoV-2 replication by targeting programmed ?1 ribosomal frameshifting,運用熒光蛋白報告基因系統聯合高通量篩選技術,鑒定出了一個可以高效抑制讀碼框移位的小分子化合物美拉沙星(merafloxacin)。
研究者們首先設計了一個報告基因系統,用于在非病毒感染的條件下指示讀碼框移位效率。在此報告基因載體中,SARS-CoV-2 FSE被放置于0位的mCherry基因和?1位的GFP基因之間。將載體轉染到HEK293T細胞中后,研究者通過觀測GFP相對于mCherry的熒光強度來計算讀碼框移位的效率。
在耶魯大學分子探索中心高通量自動加樣器的幫助下,研究者使用上述系統對一個包含4400多個化合物的小分子文庫進行了篩選,尋找能顯著影響讀碼框移位效率的化合物。通過對得到的備選化合物進行驗證,研究者最終證明merafloxacin能夠顯著抑制SARS-CoV-2報告基因系統的讀碼框移位。除了SARS-CoV-2外,merafloxacin對beta冠狀病毒屬的讀碼框移位均具有顯著的抑制作用,相反,對alpha和gamma冠狀病毒屬的-1PRF則效果較弱。另外,研究者們還檢測了已知SARS-CoV-2突變株在FSE區域的變異,發現merafloxacin對突變FSE仍然具有顯著的抑制效果。以上研究結果表明,merafloxacin特異性抑制beta冠狀病毒的讀碼框移位,并且這種抑制作用不受FSE輕度變異的影響。
為了觀察merafloxacin對病毒復制的干擾效應,研究者將不同濃度的merafloxacin加入感染了SARS-CoV-2的猴腎臟上皮細胞Vero-E6,并檢測感染48小時后的病毒滴度。研究發現,merafloxacin能顯著抑制病毒復制,其半數效應濃度(EC50)約為2.6μM。同時,通過對比讀碼框移位的效率與病毒滴度的增長率發現,讀碼框移位效率是制約SARS-CoV-2病毒增值的限速因子, 進一步表明讀碼框移位作為藥物靶點的重要性。
此項研究由耶魯大學醫學院神經科學系郭俊傑博士研究組主導,由來自多個院系的實驗室合作完成,它們包括耶魯分子探索中心Yulia Surovtseva研究組、微生物病原系Brett Lindenbach 和 Ya-Chi Ho 實驗室、分子生物物理與生物化學系Wendy Gilbert實驗室以及實驗醫學系Craig Wilen實驗室。郭俊傑實驗室的博士后孫玉博士為第一作者。
目前,merafloxacin抑制讀碼框移位的機制還不清楚。研究者推測merafloxacin可能直接作用于核糖體與病毒RNA的結合,或者抑制某一內源性調控蛋白。由于merafloxacin的天然靶標是細菌拓撲異構酶,那么它們在真核生物中的同源基因是否參與讀碼框移位的調控是值得進一步研究的方向。Merafloxacin的發現揭示了靶向讀碼框移位是一個可行且高效的抗病毒策略,適用于包括SARS-CoV-2在內的許多冠狀病毒。研究者希望通過對merafloxacin的分子結構進行優化,提高其抗病毒活性,從而使其成為一個強效的抗病毒備選藥物。
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