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  • 發布時間:2018-09-29 09:42 原文鏈接: 淺析大規模酵母雙雜交技術的發展基礎

    酵母雙雜交系統是在真核模式生物酵母中進行的,可以研究活細胞內蛋白質的相互作用,對蛋白質之間微弱的、瞬間作用也能夠通過報告基因的表達產物檢測得到。酵母雙雜交文庫構建是篩庫的前提,可用于目的蛋白的互作蛋白大規模篩選分析蛋白質間的相互作用,是現在分子生物學與生物化學常用的手段。

    幾乎所有的重要生命活動,包括DNA的復制和轉錄、蛋白質的合成與分泌、信號轉導和代謝等都離不開蛋白質之間的相互作用。酵母雙雜交技術是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質之間關系的技術。大規模雙雜交技術的發展與許多因素有關,其中一些技術的發展和應用為酵母雙雜交技術向大規模、自動化方向發展打下了基礎。美迪西提供酵母雙雜交服務,具有獨立優質實驗室,專業實驗人員,提供詳細的酵母雙雜交實驗步驟、原始數據和圖片、結果分析,可以出具權威檢測數據報告。

    1、表達文庫構建技術

    表達文庫構建技術出現較酵母雙雜交技術早,到酵母雙雜交技術出現時表達文庫構建技術已基本成熟,因此把表達文庫應用于酵母雙雜交篩選蛋白質相互作用得到了研究——(單個誘餌對獵物cDNA基因組文庫)對獵物文庫(cDNA文庫/基因組文庫)篩選蛋白相互作用, 結果大大提高了相互作用蛋白的篩選效率和規模,促進了酵母雙雜交技術研究蛋白質相互作用向大規模方向發展。

    采用不同組織器官細胞類型和分化時期的材料進行酵母雙雜交文庫構建,能分析不同亞細胞部位和功能的蛋白質,適用于部分細胞質、細胞核及膜結合蛋白。

    2、Gateway克隆技術

    Gateway克隆技術是利用λ噬菌體DNA自然條件下可與其宿主大腸桿菌DNA發生位點特異性重組整合和可逆切割分離這一機制并加以改進創建的。相對酶切構建載體來說,該技術具有需時短、操作簡單、易于各實驗室交流的特點,即只需通過簡單、高效的BP和LR反應就可實現把PCR產物定向轉入克隆質粒和表達質粒,實現PCR產物在各種質粒間的轉移。另外這一技術得到了一些大生物公司的重視,不但有各種構建好的質粒載體出售,還有利用該技術建好的各種全長ORF克隆、全長cDNA文庫等供選購,直接購買應用可簡化準備工作。

    3、PCR技術和測序技術

    PCR技術和測序技術已經實現大規模和自動化,因此使誘餌對文庫的篩選或文庫對文庫的篩選的陽性克隆測序和鑒定變得容易、快速;另外兩項技術的發展使全基因組測序成為現實,產生了許多物種的基因組序列及預測的ORF,因此,使人們對一種生物的所有預測ORF所編碼蛋白進行大規模相互作用研究成為可能。

    4、酵母交配技術

    酵母單倍體菌株有兩種相反的交配型,可交配形成二倍體酵母,因此可把DBD-X轉化入一種單倍體,AD-Y轉化入另一種單倍體,然后把分別含DBD-X、AD-Y的兩種單倍體共接種到液體培養基培養、交配后再接種到二缺板上培養。這樣只有含DBD-X和AD-Y的二倍體菌株生長,然后作表型鑒定判斷X、Y有無相互作用。顯而易見,這個過程相對順序轉化或共轉化來說,不但顯得簡單、高效,而且易于大規模和自動化。另外適合陣列篩選的配套儀器已經出現,使大規模酵母雙雜交技術變成現實。

    酵母雙雜交系統的最主要的應用是快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用,及分離新的與已知蛋白作用的配體及其編碼基因。酵母雙雜交系統檢測蛋白之間的相互作用具有以下優點:

    (1)作用信號是在融合基因表達后,在細胞內重建轉錄因子的作用而給出的,省去了純化蛋白質的繁瑣步驟。

    (2)檢測在活細胞內進行,可以在一定程度上代表細胞內的真實情況。

    (3)檢測的結果可以是基因表達產物的積累效應,因而可檢測存在于蛋白質之間的微弱的或暫時的相互作用。

    (4) 酵母雙雜交系統可采用不同組織、器官、細胞類型和分化時期材料構建cDNA文庫,能分析細胞漿、細胞核及膜結合蛋白等多種不同亞細胞部位及功能的蛋白。

     

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