小鼠胚胎干細胞培養實驗

小鼠

明膠 PBS DMEM 馬血清 L-谷氨酰胺 HEPES β-巰基乙醇 PEST LIF

培養板 離心管 水浴鍋 離心機 6孔板 24孔板

一、ES培養基
 

在LIF存在的條件下維持細胞培養。
 

二、EB培養基
 

使用細菌培養皿去除LIF后胚狀體的形成需要4天。
 

1.  分散純化細胞（參見上面的細胞傳代部分）。
 

2.  純化2小時后將細胞轉入含有ES培養基的50 ml Falcon管中，計數細胞取適量體積放入15 ml管中離心3分鐘。
 

3.  用2mlEB培養基重懸細胞，吹打至少10次制成單細胞懸液
 

4.  一個15 cm的細菌培養皿接種4～5x10⁶個細胞（1個完全融合的組織培養皿通常足以接種4個同樣規格的細菌培養皿）。
 

5.  2天后更換培養基，將胚狀體轉入錐形管中放置3～5分鐘使細胞沉降。棄去上清，將細胞重懸于新鮮培養基并接種在新的細菌培養皿中。
 

6.  用EB培養基培養的第4天將細胞轉入沒有包被的組織培養皿中（這即是細胞的移植步驟）。1個組織培養皿之中放置1個細菌培養皿，在進行第3步之前一天將胚狀體黏附在同樣規格的培養板上。
 

7.  形成胚狀體需要4天時間。在EB培養基中再培養1天使胚狀體粘附在組織培養皿的表面。這一天被認為是第2步和第3步的分界。
 

三、ITSFn培養基
 

在最少量培養基中選擇神經前體細胞
 

1.  胚狀體接種在組織培養皿一天后將培養基換成ITSFn培養基。
 

2.  并非所有胚狀體在這一時期都已經發生粘附，因此在移除培養基時要小心謹慎以使大部分胚狀體留在培養皿內。
 

3.  保持細胞在ITSFn中培養大約10天，根據需要更換培養基--大約每隔一天。
 

4.  觀察細胞形態，神經樣細胞大約出現在第4到第7天。當神經樣細胞能夠被鑒別時，轉入到第4步。步驟的轉換應該在神經前體細胞出現第一個清晰的標志幾天以后，通常是在第3步的第6到第10天。
 

四、N3培養基＋bFGF
 

通過將神經前體細胞培養在含有10ng/ml bFGF的培養基中進行擴增。
 

1.  PBS洗滌，加入1-2 ml 胰酶。
 

2.  37℃孵育5分鐘。
 

3.  用4mlEB培養基終止胰酶活*，將細胞轉入錐形管中放置3～5分鐘移出細胞團，將上清移入一新的離心管離心。
 

4.  將細胞重懸于含有bFGF的N3培養基。
 

5.  將細胞接種在包被多聚-L-鳥氨酸/纖維連接蛋白的蓋玻片上（最好將蓋玻片放于24孔培養板或6孔培養板，6孔培養板中每孔放置5個蓋玻片如果是塑料的放置4個，以使最大可能的獲得樣品數量）。24孔板接種3.5x10⁵/孔或6孔板1.7x10⁶ /孔。
 

6.  2天后更換培養基。
 

五、N3培養基

通過撤除bFGF使神經前體細胞分化。
 

1.  細胞被接種在蓋玻片上4天后將培養基換成不含bFGF的N3培養基。
 

2.  根據需要換液（大約每隔一天）。
 

3.  分化10～15天后固定細胞。
 

4.  移除培養基。
 

5.  PBS洗滌，加入4%福爾馬林，室溫放置30分鐘，PBS洗滌2次儲存于PBS。

6.  長期儲存使用含0.01%疊氮化納的PBS。
 

六、移植細胞的準備
 

細胞在胚狀體形成4天以后被移植（相應于體外分化過程中的第2步末細胞被轉種到組織培養板）。正如在前文體外分化中所描述的在移植之前4天開始形成胚狀體。通常再需要一天時間以便將胚狀體移植入一10 cm的培養皿。
 

1.  將胚狀體轉移至一15 ml 圓錐形管中放置3～5分鐘使胚狀體沉降下來。細胞被離心3分鐘會更好。放置使之沉降將會去除更多的單個細胞（包括死細胞）而這些細胞可以被離心下來。
 

2.  去除上清將胚狀體重懸于無鈣鎂離子的1xPBS中。
 

2.  離心3分鐘。
 

3.  去除上清加入1x胰酶（10 cm的培養皿加1 ml）。
 

4.  37℃水浴5分鐘。
 

5.  加入5 mlEB培養基小心吹打約10次。

6.  小心處理細胞很重要，進行細胞傳代分散細胞時不可劇烈吹打。
 

7.  離心2分鐘。
 

8.  吸出上清將細胞重懸于500 ul EB培養基。
 

9.  用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次。
 

10.  離心2次。
 

11.  吸出上清將細胞重懸于100 ul EB培養基。
 

七、煙酸己可堿標記ES細胞進行移植
 

1.  準備一10 ug/ml的煙酸已可堿染液（雙苯酰亞胺，在冷凍室118）。
 

2.  加入1 mg（你能稱到的最小量）到5 ml EB培養基（制成200 ug/ml）。
 

3.  將溶液稀釋成10 ug/ml （100 ul  200 ug/ml 溶液和1.9 ml EB培養基）。
 

4.  如前所述將細胞重懸于2 ml煙酸已可堿染液而不是EB培養基中制備ES細胞懸液。
 

5.  將懸液置于室溫（或冰上）30分鐘。
 

6.  離心2分鐘。
 

7.  吸出上清將細胞重懸于2 ml EB培養基。
 

8.  重復一次。

9.  離心2分鐘。
 

10.  吸出上清將細胞重懸于100 ul EB培養基并置于冰上。

1.需要采用高純度的水進行培養細胞。

2. 必須要在無菌的環境下操作實驗。

1. 在沒有添加LIF的條件下，培養在飼養層上的ES細胞克隆形成率和AKP染色陽性度顯著高于無飼養層培養的ES細胞。

2. 在LIF添加量達到l000IU/ml時，外源LIF與飼養層產生的基質型LIF在維持未分化狀態作用中存在有主從關系。

3. 當沒有外源LIF或量不足時，飼養層產生的分化抑制作用才會在分化抑制中發揮主要作用。