基本方案 一 種 抗 原 加 工 處 理 和 呈 遞 的 檢 測 體 系材 料具有增殖能力的（如轉化的 B 細胞）或非增殖的且與 T 雜交瘤細胞 M H C 匹配的抗原呈遞細胞（單 元 7.1) D M E M -1 0 完全培養基， 37°C 對數生長期的 T 雜交瘤細胞 抗原：溶解于水的蛋白質或多肽（對于難溶于水的多肽，需要用 DMSO 溶解且需設置溶劑對照） IL-2 E L ISA 試 劑 盒（如 Genzyme) 或見單元 5. 1 9 6 孔平底培養板 Sorvall RT- 6 0 0 0 冷凍臺式離心機及 HB-IOOO 轉子 0.22um 低蛋白結合性濾膜，僅用于多肽過濾 多道移液器及無菌槍頭 la. 對于非增殖的抗原呈遞細胞：將分離的腹腔細胞或其他非增殖或低增殖的細胞加入9 6 孔平底培養板， 2 X IO5 個細胞/孔 ，用 D M EM -IO 完全培養基將液體量調節為 lOOul/孔。 Ib. 對于具有增殖能力的細胞株：用 D M E M -10 完全培養基制備 B 細 胞 懸 液（5 X I O 5個細胞/ml) ，將細胞加入 9 6 孔平底培養板， 100ul/孔（5 X I O 4個細胞/ml)。 2 . 室溫， 400?500 g 離心收集處于對數生長期的 T 雜 交 瘤 細 胞（5 X 105?IO6 個細胞/m l ) , 將細胞懸浮于預熱的 D M E M - 1 0 完全培養基，計 數 細 胞（附 錄 3A )，將細胞濃度調節至 2 X 1 06 個細胞/ m l 。 加 入 50ul/孔（IO5 個細胞/孔）至含有抗原呈遞細胞的9 6 孔平底培養板，置 于 37°C 培養或立即進行步驟 3 操作。 3 . 制 備 lmmol/L 蛋 白 質 或 多 肽 儲 存 原 液 。將 合 成 的 多 肽 溶 解 于 去 離 子 水 中 ，用0.22um 低蛋白結合性濾膜過濾（可 儲 存 于 4°C 數月）。對于蛋白抗原，可于使用前溶解于 D M E M -10 完全培養基。 4 . 用 D M E M -10 完全培養基作連續梯度稀釋抗原，可根據濃度需要設計稀釋的梯度，抗原濃度需要大于終濃度的 4 倍以上。 5.將 50ul/孔抗原加入到含有抗原呈遞細胞和 T 雜交瘤細胞的 9 6 孔平底培養板。每個抗原濃度設三個復孔，以 及 一 系 列 空 白 對 照 孔（加 入 50ul/孔 D M E M -10 完全培養基）。繼 續 置 37C 培 養 20?24 h 。 抗 原 、抗 原 呈 遞 細 胞 和 T 雜 交 瘤 細 胞 可 按 照 任 意 次 序 加 入 。 6.400?500 g離心培養板 I O m i r u 用多道移液器將 1 〇〇ul/孔上清轉移至一新的圓底 96孔板。將原培養板一 20°C 保存以便在 IL-2 檢測出現問題時備用。 7.— 80°C 凍 存 I h 或 一 20°C 凍 存 過 夜 以 便 滅 活 混 入 上 清 的 活 細 胞（培養板可凍存于一 20°C 數周后使用）。檢測上清中 IL- 2 的 水 平（單 元 5.1)。 備 選 方 案 1 用固定后的貼壁型抗原呈遞細胞檢測加工處理過的抗原肽此方案可用于檢測 M H C I 類分子途徑或 M H C II 類分子途徑呈遞給 T 雜交瘤細胞的抗原肽。 附 加 材 料D M E M 培 養 基（無血清） 溶解于 P B S 的 2 % (m A O 多聚甲醛溶液 賴氨酸洗液 la. 對于貼壁的腹腔巨噬細胞：將分離的腹腔巨噬細胞以 2 X 105 個細胞/孔 加 入 到 9 6 孔
平底培養板，用 D M E M - I O 完全培養基將液體總量調節至 100ul/孔 。 37°C 培 養 2 h使細胞貼壁。 lb. 其他貼壁的抗原呈遞細胞：將細胞以 2 X 105 個細胞/孔加入到 9 6 孔平底培養板，用D M E M -10 完全培養基將液體總量調節至 100ul/孔 。 37°C 培養足夠的時間使細胞貼壁。對于需要過夜培養以貼壁的細胞株，細胞濃度需低 2?4 倍以便細胞增殖。 2 . 用多道移液器吹打懸浮細胞，一次吸棄一排或多排培養板孔的上清并立即加入無 1清 D M E M 100ul/孔 。其余的細胞同法處理。 3 . 將 2 % 多聚甲醛溶液與無血清 D M E M 等 量 稀 釋（多聚甲醛濃度為 1 % ) ，立 即 進 入 步驟 4 操作。如 果 在 后 續 步 驟 中 出 現 固 定 液 毒 性 問 題 ， 可 將 多 聚 甲 醛 以 0. 5 % 稀 釋 于 D M E M 。 4 . 將培養板中細胞培養液替換為固定液（IOOul/孔）。 室溫孵育 1 〇 ?15 min。 5 . 用多道移液器吸棄固定液，加 入 120ul/孔 D M E M ，為了防止固定液殘留，移液器頭應避免接觸孔壁且避免濺出。吸 棄 D M E M 并 加 入 賴 氨 酸 洗 液（120ul/孔）。室溫孵育 20?30 min。 6 . 用 D M E M 洗 板 4 次（D M E M 用量應逐漸加大，如前面兩遍可加入 150Ul/孔 ，后兩遍可 用 180ul/孔）以去除多聚甲醛。洗板結束后每孔加入 IOOiUl D M E M -10 完全培養基。 7 . 將固定的細胞和雜交瘤細胞以及抗原共培養（見基本方案，步 驟 2?5)。培養過夜后 ，檢查培養板內 T 細 胞 的 活 力（殘 留的固定液可能導致 T 細胞死亡）。 8 . 收集上清檢測 IL- 2 水 平（見基本方案步驟 6? 7 ) 。 備 選 方 案 2 用固定后的非貼壁型抗原呈遞細胞檢測加工處理過的抗原肽附 加 材 料轉 化 的 B 細胞或其他非貼壁型細胞用作抗原呈遞細胞。 D M E M 培 養 基（無血清） 2 % (m/V ) 多聚甲醛溶液，溶解 于 I3BS 賴氨酸洗液 15m l 以 及 50m l 無菌離心管 1 . 收集處于對數生長期的小鼠 B 淋巴瘤細胞， 400?500&，室溫，離 心 lOmin。 將細胞懸浮于無血清 DMEM (5 X IO6 個細胞/ml) 。 2.加入等量 2 % 多聚甲醛溶液，室 溫 孵 育 5?lOmin， 400?500 g ，室 溫 ，離 心 lOmin，棄上清后將細胞懸浮于 D M E M 中（液體量應大于或等于固定液的量），再 次 400?500 g ，室溫，離 心 lOmin。 3 . 將 細 胞 懸 浮 于 賴 氨 酸 洗 液 中 ，室 溫 孵 育 20? 30 min。離 心 棄 上 清 后 ，將細胞用D M E M 洗 2 遍 。 4 . 細胞懸浮于 D M E M 完 全 培 養 基 中（2 X IO6 個細胞/ml)，將 細 胞 加 入 9 6 孔平底培養板（2 X 105 個細胞/孔）。 5 . 將固定的細胞和雜交瘤細胞以及抗原共培養（見基本方案，步 驟 2?5)。培養過夜后 ，檢查培養板內 T 細 胞 的 活 力（殘留的固定液會導致部分 T 細胞死亡）。 6 . 收集上清檢測 IL- 2 水 平（見基本方案，步 驟 6?7) 。 備 選 方 案 3 蛋白抗原致敏的細胞固定后檢測抗原加工和處理附 加 材 料2 % (m /V ) 多聚甲醛溶液，溶 解 于 PBS 賴氨酸洗液 1.將 抗 原 呈 遞 細 胞（如分離的腹腔巨噬細胞）以 2 X 105 個細胞/孔 加 入 到 9 6 孔平底培養 板 ，培 養 使 之 貼 壁（如 巨 噬 細 胞 需 37°C 培 養 2 h )。吹打上清后將上清替換為
DMEM -IO 完 全 培 養 基（IOOm I/孔）。 2 . 用 D M E M -1 0 完全培養基連續梯度稀釋抗原，抗原濃度需大于工作濃度的 2 倍 。將稀釋的抗原加入鋪有抗原呈遞細胞的培養板（100ul/孔），包括兩排無抗原對照孔(見 步驟 7)。 37°C 培 養 一 段 時 間（如對于活化的腹腔巨噬細胞，需 培 養 2 h)。 3 . 培養結束前，將等量的無血清 D M E M 和 2 % 多 聚 甲 醛 溶 液 混 合（多聚甲醛濃度為1 % ) ，立即進入下一步操作。后 續 操 作 中 如 存 在 固 定 液 的 毒 性 問 題 ， 可 考 慮 使 用 低 濃 度 的 多 聚 甲 醛 溶 液(如 0 . 5 % ) 4 . 吸棄培養上清，用 D M E M (200^1/孔）洗滌細胞一次，加 入 固 定 液（100ul/孔），室溫固 定 10?15 min。 5 . 用多道移液器吸棄固定液，加 入 120m 1/孔 D M E M ，為了防止固定液殘留，槍頭避免接觸孔壁且避免固定液濺出。吸 棄 D M E M 并 加 入 賴 氨 酸 洗 液（120ul/孔）。室溫孵育 20?3Qmin。 6 . 用 D M E M 洗 板 4 次（所 用 D M E M 的量應逐漸加大，如前面兩遍可加入 150ul/孔 ，后兩遍可用 180u1/孔）以去除殘余的多聚甲醛。洗板結束后每孔加入 IOOmI D M E M -1 0 完全培養基。 7 . 將 T 細胞雜交瘤細胞懸浮于 D M E M 完 全 培 養 基 中（IO6 個細胞/ml)。加入細胞培養板（1 〇 5個細胞/孔）。在 一 排 對 照 孔 內（未加抗原）加 入 20ul/孔的免疫原性肽作為陽性檢測孔，其終濃度應為工作濃度的 1 0 倍（此時培養孔總體積為 220ul，但并不影響實驗結果）。 37°C 培 養 20?24 h 。 8 . 收集上清檢測 IL-2 水 平（見基本方案，步 驟 6?7) 展 | 