人臍血間充質干細胞培養流程

1. 準備：MSC 細胞培養基配制：MSC 基礎培養基 440 ml+FDCC 胎牛血清 50 ml+青霉素 5 ml+谷氨酸鹽 5 ml（一般分裝成 10 管 50 ml，后考慮 1 株僅傳 3~5 代約需多 5 管）。并于培養室內提前準備 T25 培養瓶、15 ml 離心管、50 ml 離心管、一次性塑料移液管，培養室外準備帽子、kou罩、手套、燒杯、記號筆等準備帶入。提前確保超凈臺和水浴鍋以及 37 度培養箱、4 度離心機可供使用。

2. 解凍：預冷 4 度離心機，先將東西帶進培養室，而后超凈臺消毒，打開水浴鍋預熱，將 1 管配好的 MSC 培養基預熱。從 -80 度冰箱迅速取出凍存的細胞株，將冷凍管立即放入 37 ℃ 水浴鍋中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內全部融化。 

3. 種瓶：酒精棉球消毒外表面，然后打開此凍存管，用無菌移液管移至 15 ml 離心管中，吸取 1 ml（此時的培養基是復蘇細胞用，不預熱，減少 DMSO 對細胞損傷）MSC 培養基加入凍存管中輕吹打以吸取殘余的細胞至離心管中，用 1 ml 大槍在離心管中均勻吹打至無沉淀，但亦要無氣泡，拿至 4 度離心機在 250 g 轉速下離心 5 min，回超凈臺吸走上清（寧可殘留部分上清液也不要戳入底部細胞團中），再加入 2~3 ml 預熱的 MSC 培養基輕柔重懸細胞，保證細胞分布均勻（無氣泡），用移液槍將離心管中的細胞懸液移到豎立的干凈 T25 培養瓶中，然后酒精棉球擦口后封口放倒前后左右平移保證其在瓶底面均勻鋪開（但不要碰到瓶口三角區以防后續污染）。記號筆標記，5% 濃度 CO2 下 37 度孵育過夜。

4. 種瓶后*換液：先預熱培養基，消毒臺面，而后從溫箱中取出培養瓶，先鏡下觀察粗估懸浮以及貼壁細胞比例，而后回臺面用一次性塑料移液管吸盡上清，再加加入 4 ml 預熱好的 MSC 培養基，酒精棉球消毒瓶口，封口后送入溫箱。

5. 后續換液：每 2~3 天換液一次，視細胞量而定，頻繁換液不利于細胞對于二氧化碳攝入。

6. 傳代：細胞生長達 70% 融合即可進行
（1）消毒臺面，預熱培養基，1 × PBS 以及胰酶至 37 度
（2）從原培養瓶中吸走廢液
（3）將預熱的 PBS 加 3 ml 至培養瓶中，注意加時不要沖到細胞層那面瓶壁，輕柔漂洗，再棄去 PBS，重復此步 1 次
（4）吸盡 PBS 加入 0.5~1 ml 0.25% 胰酶進行消化，鏡下觀察待細胞變圓即將脫落時立即拿到超凈臺吸去消化液，再加入預熱的培養液輕輕吹打至細胞脫落
（5）分多次將細胞懸液移至 15 ml 離心管中，殘余細胞也用培養基洗下來一并加入。
（6）250 g 離心 5 min
（7）至超凈臺吸走上清，加入細胞培養基，吹打重懸
（8）向兩個 T25 培養瓶中分別加入 2 ml 培養基，消毒瓶口后封口標記，送入溫箱（具體可視消化后細胞稠密度大致決定分幾瓶）

7. 種板：對于 MSC 細胞當傳到第 3 代或第 4 代時種板，第 6 代起細胞變的肥大基本貼壁及增殖能力就很弱了，不容易抵擋種板這一損傷大的細胞事件，消化前細胞分布約占每視野的 70% 以上，超過 90% 則提示傳代晚了。