脂質體轉染的幾個實驗方法

實驗概要

本實驗介紹了脂質體轉染的幾個方法。

實驗原理

脂質體(LR)試劑是陽離子脂質體DOTMA和DOPE的混合物(1：1)。它適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中，是目前條件下最方面的轉染方法之一。轉染率高，優于磷酸鈣法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA轉染到各種細胞。

用LR進行轉染時，首先需要優化轉染條件，應找出該批LR對轉染某一特定細胞適合的用量、作用時間等，對每批LR都要做。先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時間，DNA可從1-5ug和孵育時間6h，開始，按這兩個參數繪出相應LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者最佳的劑量，確定出轉染時間。因LR對細胞有一定的毒性，轉染時間以不超過24h為宜。

細胞種類：COS-7、BHK、NIH-3T3、Hela和Jurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞。

實驗步驟

1. 操作步驟(方法一)：

   1) 取6孔培養板，向每孔中加入2ml含(1-2) x 10⁵個細胞的培養基，37℃、18% CO₂培養基40%-60%匯合時。

   2) 轉染液制備：在聚苯乙烯管中制備以下兩液(為轉染1個空細胞所用的量)。

      A液：用不含血清培養基稀釋DNA使濃度為1-10ug，終量100ul。

      B液：用不含血清培養基稀釋LR，使終濃度為2-50ug，終量100ul。

輕輕混合A液、B液，室溫中置10-15min，稍后會出現微濁現象，但并不妨礙轉染。

   3) 轉染準備：用2ml不含血清培養基漂洗2次，再加入1ml不含血清培養基。

   4) 轉染：把A/B復合物緩緩加入培養基中，搖勻，置37℃溫箱中6-24h，吸除無血清轉染液，換入正常培養基繼續培養。

   5) 其余處理：如觀察、篩選、檢測等與其他轉染法相同。

   6) 注意：轉染時切勿加血清，血清對轉染效率有很大影響。

2. 快速脂質體轉染法操作步驟(方法二)：

   1) 將細胞以5 x 10⁵個/孔接種于6孔板中培養24h，使其達到50%-60%板底面積。

   2) 在試管中配制DNA-脂質體復合物。

      a. 在1ml無血清DMEM中稀釋PSV1-neo質粒DNA或供體DNA。

      b. 旋轉1s，再加入脂質體懸液，旋轉。

      c. 室溫下放置5-10min，使DNA結合在脂質體上。

   3) 棄去細胞中的舊液，用1ml無血清DMEM洗細胞1次后棄去，向每孔中直接加入1mlDNA-脂質體復合物，37℃培養3-5天。

   4) 再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM，繼續培養14-24h。

   5) 吸出DMEM-DNA-脂質體混合物加入新鮮含10%胎牛血清的DMEM，2ml/孔，再培養24-48h。

   6) 用細胞刮或消化法收集細胞，以備分析鑒定。

3. 穩定的脂質體轉染法：

   1) 接種細胞同前述，細胞長至50%板底面積可用于轉染。

   2) DNA-脂質體復合物制備轉染細胞同前。

   3) 在每孔中加入1ml含20%胎牛血清的DMEM，37℃培養48h。

   4) 吸出DMEM，用G418選擇性培養基稀釋細胞，使細胞生長一定時間，篩選轉染克隆，方法參照細胞克隆篩選法進行。

4. Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板轉染單層貼壁細胞。(別的方法可以參考生產商提供的protocol)

   1) 轉染前1天將0.5～2×10⁵細胞接種于24孔培養板，并加入500ul不含抗生素的完全培養基，以保證轉染時細胞匯合達90～95％。

   2) 準備復合物

      a. 將0.8ug DNA稀釋于50ul無血清無抗生素的培養液中輕輕渾勻。

      b. 將2ul Lipofectamine2000稀釋于50ul無血清無抗生素的培養液中，輕輕渾勻，室溫孵育5分。注意：必須在25分內進行。

      c. 5分后將它們混合，并輕輕渾勻，室溫孵育20分。

   3) 吸去培養板的培養基，用PBS或無血清培養基(最好)清洗細胞2次。

   4) 將復合物(總體積100ul)加入培養孔，前后搖動培養板使其分布均勻。

   5) 將細胞放入培養箱孵育4～6h后，可以更換含血清培養液去除復合物(也可不用)。

   6) 24～48h后可以觀察轉入基因表達情況。

   7) 穩定轉染：換含血清培養基24h后將細胞以1：10(或更高比例)傳代，1天后更換篩選培養基篩選。

   8) 優化：要保證細胞匯合率達90～95％(比較高)；DNA/ Lipofectamine2000比率1：0.5～1：5，一般細胞1：2～3。