陳文學 鄒學森 陳岳青 黃秀珍 鐘禮瀑
（江西省腫瘤醫院 腫瘤研究所， 江西 南昌 330029）
[摘要] 熒光定量PCR技術具有簡便、靈敏、準確等優點，目前已經在乙肝和性病的診斷和治療中得到了廣泛的應用，但在腫瘤方面的應用還處在研究和開發階段。本文綜述近年國內外相關熒光定量PCR技術在腫瘤研究中的應用。
[關鍵詞] FQ-PCR；腫瘤；人乳頭瘤病毒；EB病毒
腫瘤是危害人類健康的一種疾病，它的惡性程度與預后判斷主要依靠是否有轉移和病理切片分期。隨著分子生物學的迅猛發展，腫瘤研究領域的大量研究成果顯示，腫瘤的發生、發展、治療和預后與腫瘤細胞內部基因和腫瘤相關病毒有關。本文綜述了熒光定量PCR技術的原理及其在腫瘤研究中的應用。
1.單管熒光定量PCR技術的原理
單管熒光定量PCR（fluorogenic quantitative PCR, FQ PCR）的反應體系中除了普通PCR所需的引物外，還有一條熒光探針，探針的5`端標記了熒光報告基團，3`端標記了熒光淬滅基團，當這條探針保持完整時，熒光淬滅基團抑制熒光報告基團發出熒光。PCR反應開始后，隨著DNA鏈的延伸，Taq酶的5`-3`外切酶活性將熒光探針切斷，熒光淬滅基團的作用消失，熒光報告基團就發出了熒光信號，熒光信號的強弱與PCR的產物數量成正比，根據測量到的熒光信號強弱，通過分析軟件得到樣本的原始拷貝數。
2. FQ—PCR的優點
FQ—PCR技術是融合了PCR技術與DNA探針雜交技術的優點，實驗的整個過程只在加樣時打開1次反應管，在PCR的每個循環中可以直接監測到熒光信號的變化，根據PCR反應酶動力學特點分析軟件會自動對DNA進行定量，因此也有人稱FQ-PCR為實時熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR）。其優點為：①FQ-PCR解決了傳統PCR技術不能定量和擴增產物污染的問題。②避免了普通定量PCR操作過程中的污染，FQ-PCR只在加樣時打開反應管1次。③FQ-PCR操作簡便、快捷、結果準確，不需要普通PCR擴增后進行電泳或放射自顯影觀察結果，方便了臨床上應用。④FQ-PCR可以對每一批擴增樣本進行擴增效率的評價。對DNA做系列稀釋，每個稀釋濃度的DNA對數值與其Ct值做回歸分析，PCR的擴增效率的計算方法為：效率=10-1/斜率。通過計算擴增效率可以對儀器、操作人員和試劑進行綜合評定。
3. FQ-PCR在血液系統腫瘤中的應用
Jones CD（1）對FQ-PCR技術預測慢性髓性白血病（CML）病人的髓外增的有效性進行了評價。FQ-PCR方法檢測372例臨床標本和50例外周血標本p210和 p190 bcr-abl RNA 融合基因的轉錄水平，用看家基因對結果進行標準化，檢測結果為特異性100%。敏感性研究顯示，細胞系稀釋到0.0001%時仍然可以檢測到bcr-abl，重復性實驗顯示組間變異系數（CV）為12.3%，組內變異系數為13.8。實驗結果顯示FQ-PCR是一種非常可靠的監測bcr/abl陽性CML病人的方法。
熒光原位雜交（FISH）的結果顯示10%-15%的CML病人bcr-abl雜合子缺失，這樣的病人預后非常差。FQ-PCR方法可以鑒定CML病人雜合子亞單位上的微小缺失，這種微小的缺失難于用FISH方法分辨出來。Kolomietz（2）用FQ-PCR方法對25例預后差的病人進行檢測，18例無微小缺失CML病人獲相對較好的治療效果。
Hughes等（3）將1106例CML病人隨機分為imatinib(蛋白激酶抑制劑)治療組和INF-a+卡鉑治療組，用FQ-PCR檢測2個治療組病人血液中bcr-abl的轉錄水平，結果顯示imatinib治療組12個月后bcr-abl的轉錄水平降低了3個數量級，治療效果明顯優于INF-a+卡鉑治療組。CML病人bcr/abl的轉錄水平降低了3個數量級或無轉錄者，預后較好。
4. FQ-PCR在乳腺癌中的應用
Weigelt等（4）用FQ-PCR方法檢測94例乳腺癌轉移的病人外周血CK19、p1B、PS2 和 EGP2的mRNA水平，通過QDA將4個基因綜合成一個評價指標。在77例乳腺癌骨轉移的病例中發現QDA陰性病人的存活率明顯高于QDA陽性病人(P=0.015 、0.0053)，QDA陽性的病人1年存活率為3%，2年的總存活率為17%，而QDA陰性的病人存活率為36%。
ANG1 和ANG2是腫瘤細胞分泌的促進腫瘤細胞生長和轉移的因子，Sfiligoi（5）研究了ANG與腫瘤細胞淋巴結轉移和腫瘤病人的生存率之間的關系。38例乳腺癌活檢標本提取mRNA,用FQ-PCR技術測定ANG1 和ANG2基因水平，檢測結果與臨床病理和臨床生化指標相比較，發現ANG2與腋窩淋巴結轉移有高度的相關性，單變量和多變量生存分析顯示，ANG2 mRNA 水平與疾病（p < 0.0001）、總存活率(p < 0.0003)呈單因素高度相關性。
5. FQ-PCR在胃腸道腫瘤中的應用
胃癌手術后的腹膜播散是胃癌復發的常見原因。Ueno（6）對124例胃癌手術病人實施腹腔灌洗，FQ-PCR技術檢測灌洗液中CEA水平，結果顯示CEA的Ct值與腫瘤的侵犯深度、淋巴結的轉移、血管轉移、腫瘤分期、存活率有高度的相關性。CEA的Ct值預測腫瘤腹膜轉移的敏感性為76.9%，特異性為67.7%，而細胞學檢測的敏感性只有23.1%。這些實驗數據顯示，FQ-PCR技術檢測灌洗液中CEA水平，對預后和診斷是否有腹膜轉移是一個很好的指標。
alpha4GnT是一種糖苷轉移酶，它只存在于胃癌細胞中，外周血中檢測不到。Shimizu（7）對37例胃癌病人和23名健康人外周血alpha4GnT的mRNA進行熒光定量檢測，胃癌病人的檢出率為62.2%，而健康人未檢測出陽性。令人振奮的是有5例早期胃癌病人，胃癌侵犯只局限在粘膜層，alpha4GnT的mRNA的檢出率達到80%。慢性胃炎、胃幽門螺桿菌感染的良性病變的alpha4GnT mRNA水平明顯低于胃癌病人。這些結果表明定量檢測外周血中alpha4GnT的mRNA是對胃癌的一個很好的檢測指標。
肝癌的早期發現對肝癌的治療和預后非常重要，Chuma（8）對7個早期肝癌結節和7個進展期肝癌結節的12 600個基因進行了定量分析，發現95個基因可以區分早期肝癌和正常組織，92個基因可以區分早期肝癌和進展期肝癌，其中熱休克蛋白70基因（HSP70）在早期肝癌結節中明顯上調，與癌前病變組織、正常組織存在明顯差異（p<0.001）。