1.儀器裝置
電泳室及直流電源同紙電泳。
2.試劑
(1) 醋酸-鋰鹽緩沖液(pH3.0)
取冰醋酸 50ml,加水800ml混合后,用氫氧化鋰調節pH**3.0,再加水**
1000ml。
(2) 甲苯胺藍溶液
取甲苯胺藍 0.1g,加水100ml使溶解。
3.操作法
(1)制膠
取瓊脂糖約 0.2g,加水10ml,置水浴中加熱使溶脹完全,加溫熱的醋酸-鋰鹽緩沖液(pH3.0)10ml,混勻,趁熱將膠液涂布于大小適宜(2.5cm×7.5cm或4cm×9cm)的玻璃板上,厚度約 3mm,靜置,待凝膠結成無氣泡的均勻薄層,即得。 (2) 標準品溶液及供試品溶液的制備照各藥品項下規定配制。
(3) 點樣與電泳
在電泳槽內加入醋酸-鋰鹽緩沖液(pH3.0),將凝膠板置于電泳槽架上,經濾紙橋浸入緩沖液。于凝膠板負極端分別點樣 1μl,立即接通電源,在電壓梯度約 30V/cm,電流強度1~2mA/cm的條件下,電泳約20分鐘,關閉電源。
(4) 染色與脫色
取下凝膠板,用甲苯胺藍溶液染色,用水洗去多余的染色液**背景無色為止。
四、聚丙烯酰胺凝膠電泳法
1.儀器裝置
通常由穩流電泳儀和圓盤或平板電泳槽組成。其電泳室有上、下兩槽,每個槽中都有固定的鉑電極,鉑電極經隔離電線接于電泳儀穩流擋上。
2.試劑
(1)溶液 A
取三羥甲基氨基甲烷 36.6g,四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L鹽酸溶液48ml,再加水溶解并稀釋** 100ml,置棕色瓶內,在冰箱中保存。
(2)溶液 B
取丙烯酰胺 30.0g、次甲基雙丙烯酰胺0.74g,加水溶解并稀釋**100ml,濾過,置棕色瓶內,在冰箱中保存。
(3)電極緩沖液(pH8.3)
取三羥甲基氨基甲烷 6g、甘氨酸28.8g,加水溶解并稀釋**1000ml,置冰箱中保存,用前稀釋 10倍。
(4)溴酚藍指示液
取溴酚藍 0.1g,加0.05mol/L氫氧化鈉溶液3.0ml與90%乙醇5ml,微熱使溶解,加 20%乙醇制成250ml。
(5)染色液
取 0.25%(W/V)考馬斯亮藍G<[250]>溶液2.5ml,加12.5%(W/V)三氯醋酸溶液** 10ml。
(6)稀染色液
取上述染色液 2ml,加12.5%(W/V)三氯醋酸溶液**10ml。
(7)脫色液
(2)標準品溶液及供試品溶液的制備
照各藥品項下的規定。
(3)電泳
將已制好的凝膠玻璃管裝入圓盤電泳槽內,每管加供試品或標準品溶液50~100μl,為防止擴散可加甘油或40%蔗糖溶液1~2滴及0.04%溴酚藍指示液 1滴,也可直接在上槽緩沖液中加0.04%溴酚藍指示液數滴,玻璃管的上部用電極緩沖液充滿,上端接負極、下端接正極。調節起始電流使每管為1mA,數分鐘后,加大電流使每管為 2~3mA,當溴酚藍指示液移**距玻璃管底部1cm處,關閉電源。
(4)染色和脫色
電泳完畢,用裝有長針頭并吸滿水的注射器,自膠管底部沿膠管壁將水壓入,膠條即從管內滑出,將膠條浸入稀染色液過夜或用染色液浸泡 10~30分鐘,以水漂洗干凈,再用脫色液脫色**無蛋白區帶凝膠的底色透明為止。
(5)結果判斷將膠條置燈下觀察,根據供試品與標準品的色帶位置和色澤深淺程度進行判斷。
相對遷移率 供試品和標準品的電泳區帶有時可用相對遷移率(R''<[m]>)進行比
較。其計算式如下: 進膠端到供試品或標準品區帶的距離 相對遷移率(R''<[m]>)=──進膠端到溴酚藍區帶的距離 掃描 將清晰的膠條置雙波長薄層掃描儀或凝膠電泳掃描儀中掃描并積分,由各組分的峰面積計算百分含量。7%醋酸溶液。
3.操作法
(1)制膠
取溶液 A2ml,溶液B5.4ml,加尿素2.9g使溶解,再加水4ml,混勻,抽氣趕去溶液中氣泡, 加 0.56%過硫酸銨溶液2ml,混勻制成膠液,立即用裝有長針頭的注射器或細滴管將膠液沿管壁加**底端有橡皮塞的小玻璃管(10×0.5cm)中,使膠層高度達 6~7cm, 然后徐徐滴加水少量,使覆蓋膠面,管底氣泡必須趕走,靜置約 30分鐘,待出現明顯界面時即聚合完畢,吸去水層。