基因芯片的必備知識和操作流程

　　基因芯片 技術的誕生為生物技術工作人員打開了一道科研的便利之門，曾被評為1998年年度十大科技進展之一。本文對基因芯片的實驗原理、技術基礎、分類、用途、操作主要環節等內容做詳細的介紹。

　　1.基本原理和技術基礎

　　基因芯片以DNA雜交 為基本原理，基于A和T、G和C的互補關系。它是在探針的基礎上研制出的。所謂探針是一段人工合成或篩選出的已知順序的堿基序列，樣品分子上連接有一些cy3、cy5等可檢測的物質。

　　經激光共聚焦熒光顯微鏡檢出雜交或反應信號，通過計算機處理、分析，即可獲得所需信息。例如，用紅、綠熒光分別標記實驗樣本和對照樣本的cDNA，混合后與微陣列雜交，可顯示實驗樣本和對照樣本基因的表達強度(顯示紅色、綠色或黃色)，由此可在同一微陣列上同時檢測兩樣本的基因表達差異。

　　在基因芯片工作過程中，固定位點使用不同分子生物學技術和堿基互補配對原則與待測基因片段雜交，并通過自動閱讀設備分析雜交結果，達到定性、定量分析的目的。

　　基因芯片通過應用平面微細加工技術和超分子自組裝技術，把大量分子檢測單元集成在一個微小的固體基片表面，可同時對大量的核酸等生物分子實現高效、快速、低成本的檢測和分析。

　　基因芯片的檢測主要建立在放射標記技術、熒光 標記技術、質譜分析、化學發光等技術上。使用熒光標記的基因芯片需要專用的熒光掃描儀。對于高密度的基因芯片，目前最常用的是激光共聚焦顯微鏡和高性能的冷卻CCD。

　　目前專用于熒光掃描的掃描儀大致分為兩類：一類是基于CCD(charge-coupled device，電荷耦合裝置)的檢測光子；另一類則是基于PMT(photomultiplier tube，光電倍增管)的檢測系統。

　　生物芯片的發展得益于微細加工技術和現代分子生物技術的結合。隨著人類基因組計劃的實施，現代分子生物技術也取得了巨大突破：體外基因擴增技術實現了核酸樣品的快速制備和放大，基因擴增后可進行基因測序，而基因探針技術使得基因測序的檢測自動化成為可能，極大地促使了生物芯片的發展。

　　微陣列的加工借助的是微電子工業中應用十分成熟的光學光刻技術和微機電系統加工中所采用的各種方法，根據要求在玻璃、塑料、硅片等基底材料上加工出用于生物樣品分離、反應的各種微細結構，然后在微結構上施加表面化學處理。

　　光學光刻的第一步是通過光學制板照相制備掩模。制備好的掩模通常是鍍有鉻層的石英玻璃板，該鉻層事先已按微細結構的圖形被刻蝕成透光和不透光兩個部分。第二步是光刻，讓掩模與表面涂有光刻膠的硅片接觸，然后讓光源通過掩模照射到硅片上。

　　通過顯影光刻膠中的圖形，使其上未被掩模遮掩的部分被溶解除去。上述工作完成之后，通過對無膠保護的硅片用腐蝕劑蝕刻，再去除剩余的光刻膠便可獲得所需生物芯片的微細結構。

　　微米級甚至納米級的微細加工技術使得數以萬計的生物探針(DNA片段、抗原和抗體)等微觀結構成功地排列在很小的芯片載體上，從而保證了生物芯片檢測的集成化、微型化和高通量化。

　　2.基因芯片的分類

　　基因芯片是分子生物學和微細加工技術(micro fabrication technology)相結合的產物，分類方法有多種。分類的依據主要有制作方法、載體材料、載體上所固定的DNA的種類、用途等。

　　1)根據制作方法，可將基因芯片分為原位合成芯片與合成后點樣芯片(王升啟等，1999)。前者利用光引導聚合技術(1ight-directed synthesis)或壓電打印法(piezoelec-tric printing)進行原位合成寡聚核苷酸探針，以美國Affymetrix公司的芯片產品為代表；后者主要利用微型機械點樣法或化學噴射法將合成好的探針、cDNA或基因組DNA通過特定的高速點樣機器直接點在芯片片基上。

　　2)根據芯片上固定的探針數量，可以將基因芯片分為高密度芯片和中低密度芯片兩類。高密度芯片上的探針數量從幾萬到上百萬，主要是通過原位合成制備的寡核苷酸芯片，以及通過將數萬個基因或者EST序列的PCR擴增產物直接點至芯片上制備的cDNA芯片。

　　高密度基因芯片主要用于大規模的基因表達譜測定、藥物篩選和新藥開發、基因功能探索等方面。中低密度芯片中探針的數目一般在幾十到幾千不等，一般是通過合成后點樣制備的芯片，主要用于基因突變分析、基因表達譜分析等領域。

　　基因芯片的主要特點是高通量。實際上中低密度芯片是基因芯片在臨床應用上的發展趨勢，原因主要是以下兩點：

　　①盡管多數疾病的影響因素很多，但是在診斷和鑒別中的目的是具體的，所以檢測需要低通量的；

　　②中低密度芯片檢測的指標較少，各指標問的相互影響作用較小，在制作工藝和檢測結果上更能保證準確性。

　　3)根據芯片上探針的不同，可將基因芯片分為寡核苷酸芯片和cDNA芯片。

　　①寡核苷酸芯片：用照相平版印刷術(photolithography)和固相合成術結合在基片上生成寡核苷酸，由Fodor首先在1991年報道。該技術是先在玻片上涂上光敏化學材料，蓋上罩，根據所要合成的堿基序列決定罩的透光位點。

　　光照局部產生去防護作用，用所需核苷酸沖洗玻片，該核苷酸即在去防護部位粘合于玻片。核苷酸的5'端修飾以光不穩定的保護基團，該基團經光照而去保護，與下一個核苷酸結合。如此重復直至獲得所需核苷酸長度。

　　每一層各點的A、T、C、G不同，故每合成一層核苷酸需要4個不同透光位點的罩和A、T、C、G分別沖洗一次。通過4×n次步驟可合成含有n個核苷酸的寡核苷酸鏈。其主要特點是可按需要設計一定序列的寡核苷酸鏈。美國的Affymetrix公司已能生產40萬個寡核苷酸/1.6cm2的芯片。

　　②cDNA 芯片：將特定的或文庫的cD-NA經PCR擴增后用機械手點到基片上。最先由Schena于1995年報道。美國Synteni公司的cDNA微陣列已達10^4cDNA/3.6cm^2。

　　4)根據芯片用途，可以將芯片分為基因表達譜芯片、測序芯片、診斷芯片等。基因表達譜芯片技術是一種領先的研究方法。例如，通過對人類基因組中成千上萬個基因的表達水平進行高通量檢測來尋找具有差異的基因表達，從而預測個體患者的病程發展及治療效果，以最終實現疾病的個體化治療。

　　DNA測序芯片則是基于雜交測序發展起來的，其原理是任何線狀的單鏈DNA或者RNA序列均可以分解成一系列堿基數固定、錯落而重疊的寡核苷酸，又稱為亞序列，如果能把原序列所有的錯落重疊的亞序列全部測出，就可以據此組建出原序列。

　　5)根據載體材料不同，可將基因芯片分為尼龍膜、玻璃片、塑料片、硅膠晶片、微型磁珠等。

　　3.基因芯片的主要技術環節

　　基因芯片技術能夠提供極為豐富的信息，但其操作流程并不復雜。應用基因芯片進行實驗的操作過程主要包括以下4個環節。其基本要點為：芯片方陣的構建、樣品的制備、雜交反應和信號的檢測及分析。

　　1.方陣的構建

　　1)探針的制備。芯片的類型不同，制備探針的方法也不盡相同。如果是檢測表達譜，需要從待檢測樣品mRNA或者總RNA中制備cDNA探針；如果是SNP檢測，則需要從待檢測樣品DNA中通過PCR制備探針或者人工合成寡核苷酸探針。

　　2)片基處理。目前制備芯片主要采用表面化學的方法或組合分類化學的方法來處理片基，然后使DNA片段按順序排列在芯片上。經特殊處理過的玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硅膠晶等都可作為載體材料。探針的固定化方法目前常用兩種：寡聚賴氨酸法、醛基一氨基法，其他方法(如巰基一雙硫鍵法)也在研究中。固定化的效率也不同。

　　3)點樣。因芯片種類較多，點樣方法也不盡相同，但基本上可分為原位合成與微矩陣點樣兩大類。

　　①原位合成是目前制造高密度寡核苷酸最為成功的方法，具體又可分為光引導原位合成、噴墨打印和分子印跡原位合成三種方法。

　　這三種技術所依據的固相合成原理相似，只是在合成前體試劑定位方面采取了不同的解決辦法，由于原位合成的短核酸探針陣列具有密度高、雜交速度快、效率高等優點，而且雜交效率受錯配堿基的影響很明顯，所以原位合成的DNA微點陣適合于進行突變檢測、多態性分析、表達譜檢測、雜交測序等需要大量探針和高的雜交嚴謹性的實驗。

　　②微矩陣點樣法是將PCR等得到的。DNA或生物分子用針點或噴射的方法直接排列到載體上。該方法在多聚物的設計方面與前者相似，合成工作用傳統的DNA合成儀完成，只是合成后用特殊的自動化微量點樣裝置將其以比較高的密度涂布于芯片載體上。

　　2.樣品的制備

　　生物樣品是復雜的生物分子混合體，一般不能直接與芯片反應，必須將樣品進行生物處理。對于基因芯片，組織中獲取的DNA/mRNA樣品必須通過擴增(PCR)以提高檢測的靈敏度。

　　1)細菌性樣本。檢測的對象如果是細菌性樣本，在必要的情況下，首先應該進行增菌處理，然后使用合適的方法提取樣本中的DNA，設計特異或通用的引物進行PCR擴增，使樣品分子標記上可以檢測的熒光分子。

　　美國Mosaic技術公司發展的一種固相PCR系統包含兩套引物，每套引物都可從靶基因兩頭延伸(Chang et a1.，2004)。當引物和DNA樣品及PCR試劑相混時，如果樣品包含靶序列，DNA就從引物兩頭開始合成，并在引物之間形成雙鏈DNA環。由于上述反應在固相中產生，避免了引物競爭現象，并可減少殘留物污染和重復引發。

　　2)病毒性樣本。如果待檢樣本是病毒，DNA病毒的操作過程與細菌性樣本的操作過程相似，而RNA病毒則需要加入一個RT-PCR過程。目前，已有多種PCR方法廣泛使用，目的是提高擴增效率和特異性，如TouchDown PCR、巢式PCR、長距離PCR等。

　　3.雜交反應

　　樣品與芯片的雜交反應中涉及的因素主要有雜交溫度、雜交時間、雜交液的成分等。生物分子反應是生物芯片技術中除方陣構建外最重要的一步，其復雜的程度和具體控制條件由芯片中基因片段的長短和芯片本身的用途而定。

　　如果是基因表達檢測，反應時需要高鹽濃度、低溫和長時間。如果要檢測是否有突變，因涉及單個堿基的錯配，故需要在短時間內、低鹽、高溫條件下高特異性雜交。

　　4.信號的檢測和分析

　　信號檢測與分析即對生化反應所得結果的分析測定。基因芯片在與熒光標記的目標DNA或RNA雜交后，必須用激光共聚焦掃描芯片和CCD芯片掃描儀將芯片測定結果轉變成可供分析處理的圖像數據，此方法重復性好，但是靈敏度相對較低。

　　目前正在研究的替代方法有質譜法、化學發光和光導纖維、二極管方陣檢測、乳膠凝集反應、直接電荷變化檢測等。生物芯片還需一個專門的系統來處理芯片數據，一個完整的芯片數據處理系統應該包括芯片圖像分析和數據提取以及芯片數據的統計學分析和生物學分析，另外還要做芯片的數據庫管理、芯片表達基因的國際互聯網上檢索。

　　基因芯片這個詞聽起來挺高深的，不過實驗操作流程卻不復雜。需要注意的是，由于芯片的類型不同，探針的制備方法也會有所差異。了解更多基因芯片相關軟件、知識點、公司品牌等可移步生物幫DNA芯片專題 。