常用生化實驗技術：分光光度法1

有色溶液對光線有選擇性的吸收作用，不同物質由于其分子結構不同，對不同波長光線的吸收能力也不同，因此，每種物質都具有其特異的吸收光譜。有些無色溶液，雖對可見光無吸收作用，但所含物質可以吸收特定波長的紫外線或紅外線。分光光度法主要是指利用物質特有的吸收光譜來鑒定物質性質及含量的技術，其理論依據是Lambert和Beer定律。

分光光度法是比色法的發展。比色法只限于在可見光區，分光光度法則可以擴展到紫外光區和紅外光區。比色法用的單色光通過濾光片產生，譜帶寬度為40~120nm，精度不高，而分光光度法則要求近于真正單色光，其光譜帶寬最大不超過3~5nm，在紫外光區可到l nm以下。單色光通過棱鏡或光柵產生，具有較高的精度。

第一節基本原理

一、光的基本知識

光是由光量子組成的，具有二重性，即不連續的微粒性和連續的波動性。波長和頻率是光的波動性的特征，可用下式表示：

λ＝C／υ

式中λ為波長，具有相同的振動相位的相鄰兩點間的距離叫波長。υ為頻率，即每秒鐘振動次數。c為光速，等于299 770±4km／s。光屬于電磁波。

自然界中存在各種不同波長的電磁波，列成表l-l所示的波譜圖。分光光度法所使用的光譜范圍在200nm~10μm(1μm＝1 000nm)之間。其中200~400nm為紫外光區，400~760nm為可見光區，760~10 000 nm為紅外光區。

二、朗伯一比爾(1ambert—Beer)定律

朗伯—比爾定律是比色分析的基本原理，這個定律是討論有色溶液對單色光的吸收程度與溶液的濃度及液層厚度間的定量關系。此定律是由朗伯定律和比爾定律歸納而得。

1．朗伯定律一束單色光通過溶液后，由于溶液吸收了一部分光能，光的強度就要減弱：若溶液濃度不變，則溶液的厚度愈大(即光在溶液中所經過的途徑愈長)，光的強度減低也愈顯著。

設光線通過溶液前的強度為Io(入射光的強度)，通過液層厚為L溶液后．光的強度為It（透過光的強度），則表示透過光的強度是入射光強度的幾分之幾，稱為透光度（transmittance）,用T表示。透光度隨溶液厚度的增加而減少，但實踐證明，透光度和溶液層厚度間并不存在簡單的定量關系，只有透光度的負對數(-lgT)才隨著溶液厚度的增加而成正比例增加，即

將上述比例寫成等式，得到

式中稱為吸光度(A)(absorbance)，又稱為消光度(E)(degree of extinction)或光密度（D）(optical density)。所以

A＝K1L

式中K1為比例系數，其值取決于入射光的波長，溶液的性質和濃度以及溶液的溫度等。

上式表明，當溶液的濃度不變時，吸光度與溶液液層的厚度成正比，這就是朗伯定律。

表1-1 電磁波譜

2．比爾定律當一束單色光通過有色溶液后，溶液液層的厚度不變而濃度不同時，溶液度愈大，則透射光的強度愈弱，其定量關系如下：

A＝K₂C

式中C為有色物質溶液的濃度；K₂為比例系數，其值取決于入射光的波長，溶液的性質和液層的厚度，以及溶液的溫度等。

上式表明，當溶液液層的厚度不變時，吸光度與溶液的濃度成正比，這就是比爾定律。