實驗方法原理
常用堿性染料進行簡單染色,這是因為:在中性、堿性或弱酸性溶液中,細菌細胞通常帶負電荷,而堿性染料在電離時,其分子的染色部分帶正電荷(酸性染料電離時,其分子的染色部分帶正電荷)。因此堿性染料的染色部分很容易與細菌結合使細菌著色。經染色后的細菌細胞與背景形成鮮明的對比,在顯微鏡下更易于識別,常用作簡單染色的染料有:美藍、結晶紫、堿性復紅等。
當細菌分解糖類產酸使培養基 pH 下降時,細菌所帶正電荷增加,此時可用伊紅、酸性復紅或剛果紅等酸性染料染色。
實驗材料 枯草芽孢桿菌 (12-18 h 營養瓊脂斜面培養物)藤黃微球菌(約 24 h 營養瓊脂斜面培養物)
試劑、試劑盒 呂氏堿性美藍染液/草酸按結晶紫染液齊氏石炭酸復紅染液
儀器、耗材 顯微鏡酒精燈載玻片接種環雙層瓶(內裝香柏油和二甲苯)擦鏡紙生理鹽水
實驗步驟
1. 涂片
取兩塊載玻片,各滴一小滴(或用接種環挑取 1~2 環)生理鹽水(或蒸餾水)于玻片中央,用接環以無菌操作(圖 IV-1)分別從枯草芽泡桿菌和藤黃微球菌斜面上挑取少許菌苔于水滴中,混勻井涂成薄膜。若用菌懸液(或液體培養物)涂片可用接種環挑取 2~3 環直接涂于載玻片上(圖 IV-2)。
2. 干燥
室溫自然干燥。
3. 固定
涂面朝上,通過火焰 2~3 次。
此操作過程稱熱固定,其目的是使細胞質凝固,以固定細胞形態。并使之牢固附著在載玻片上。
4. 染色
將玻片平放于玻片擱架上,滴加染液于涂片上(染液剛好覆蓋涂片薄膜為宜)。呂氏堿性美藍染色 1~2 min,石炭酸復紅(或草酸銨結晶紫)染色約 1 min。
5. 水洗
倒去染液。用自來水沖洗,直至涂片上流下的水無色為止。
6. 干燥
自然干燥,或用電吹風吹干,也可用吸水紙吸干。
7. 鏡檢
涂片干后鏡檢。
注意事項
1. 載玻片要潔凈無油斑,滴生理鹽水和取菌不宜過多,涂片要涂抹均勻。不宜過厚。
2. 熱固定溫度不宜過高(以玻片背面不燙手為宜),否剿會改變甚至破壞細胞形態。
3. 水洗時不要直接沖洗涂面,而應使水從載玻片的一端流下。水流不宜過急、過大,以免涂片薄膜脫落。
4. 涂片必須完全干燥后才能用油鏡觀察。
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