聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain
Reaction，PCR)可對特定核苷酸片斷進行指數級的擴增。在擴增反應結束之后，我們可以通過凝膠電泳的方法對擴增產物進行定性的分析，也可以通過放射性核素摻入標記后的光密度掃描來進行定量的分析。無論定性還是定量分析，分析的都是PCR終產物。但是在許多情況下，我們所感興趣的是未經PCR信號放大之前的起始模板量。例如我們想知道某一轉基因動植物轉基因的拷貝數或者某一特定基因在特定組織中的表達量。在這種需求下熒光定量PCR技術應運而生。
實時熒光定量PCR技術（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction簡稱Real Time PCR）是在定性PCR技術基礎上發展起來的核酸定量技術。實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied biosystems公司推出，在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，使每一個循環變得“可見”，最后通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA(orcDNA)的起始濃度進行定量的方法。實時熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA(或cDNA)拷貝數最敏感、最準確的方法。如果用于RNA檢測，這被稱為逆轉錄實時PCR即（Real-time RT-PCR）是實時PCR法，它是指對DNA或經過反轉入（RT-PCR）的RNA通過聚合酶鏈式反應并實時監測DNA的放大過程，在擴增的指數增長期就測量擴增產物，因為擴增指數增長期測量值與特異DNA（RNA）起始量存在相關性，從而實現定量檢測。RealTime PCR的基本目標是精確測量和鑒別非常微量的特異性核酸，從而可通過監測CT值而實現對原始目標基因的含量定量。實時熒光定量PCR法最大的優點是克服了終點PCR法進入平臺期或叫飽和期后定量的較大誤差，實現DNA/RNA的精確定量。該技術不僅實現了對DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實現多重反應、自動化程度高、無污染、實時和準確等特點，該技術在醫學臨床檢驗及臨床醫學研究方面有著重要的意義。
microRNA實時熒光定量PCR的技術特點
雖然microRNA實時定量PCR是一種最近才發展起來的檢測技術，其技術細節還在不斷完善中，但是microRNA實時定量PCR檢測系統，相對其它microRNA檢測技術有以下優點：
高特異性，可以只對成熟microRNA進行定量，有效區分成熟microRNA分子和前體分子以及其它成熟microRNA的同源分子；
快速，簡單，省時，整個操作只需兩步，不到3個小時，即可獲得高質量的數據；
檢測靈敏度高，樣品消耗少，僅需1-10ng的總RNA或50pg左右的microRNA；
超寬的線性范圍，可跨越7個數量級。
實時定量PCR的系統構成及工作原理
熒光定量檢測系統由實時熒光定量PCR儀，實時熒光定量試劑，通用電腦，自動分析軟件等構成。設備由熒光定量系統和計算機組成，用來監測循環過程的熒光。
與實時設備相連的計算機收集熒光數據。數據通過開發的實時分析軟件以圖表的形式顯示。原始數據被繪制成熒光強度相對于循環數的圖表。原始數據收集后可以開始分析。實時設備的軟件能使收集到的數據進行正常化處理來彌補背景熒光的差異。正常化后可以設定域值水平，這就是分析熒光數據的水平。樣品到達域值水平所經歷的循環數稱為Ct值（限制點的循環數）。域值應設定在使指數期的擴增效率為最大，這樣可以獲得最準確，可重復性的數據。如果同時擴增的還有標有相應濃度的標準品，線性回歸分析將產生一條標準曲線，可以用來計算未知樣品的濃度。
