Label-free live brain imaging and targeted patching with third-harmonic generation microscopy
Stefan Wittea,b,1, Adrian Negreana,b,c, Johannes C. Lodderb,c, Christiaan P. J. de Kockb,c, Guilherme Testa Silvab,c,
Huibert D. Mansvelderb,c,2, and Marie Louise Groota,b,2
aBiophysics Group, Institute for Lasers, Life, and Biophotonics Amsterdam, VU University, De Boelelaan 1081, 1081 HV, Amsterdam, The Netherlands;
cIntegrative Neurophysiology, Centre for Neurogenomics and Cognitive Research, VU University, De Boelelaan 1085, 1081 HV, Amsterdam, The
Netherlands; and bNeuroscience Campus Amsterdam, De Boelelaan 1085, 1081 HV, Amsterdam, The Netherlands
Edited* by Margaret M. Murnane, University of Colorado, Boulder,
CO, and approved February 18, 2011 (received for review December 15,
2010)
摘要
在神經科學和神經外科中對活體大腦組織中神經元的成像能力是一項基本要求。尤其是需求一種具有測微計尺分辨率的大腦形態學的非侵入探針的開發，因為它可以在臨床診斷上提供一種非侵入式光學活體組織檢查的手段。在這一領域，雙光子激光掃描顯微鏡(2PLSM)是一個強大工具，并已成為活體生物樣品最小侵入性損害的高分辨率成像的標準方法。但是，(2PLSM)基于光學方法提供足夠分辨率的同時，對熒光染料的需求妨礙了圖像對比度的提高。本文中，我們提供了一種活體大腦組織以細胞分辨率的高對比度成像方法，無需熒光探針，使用光學三次諧波發生進行成像。我們利用細胞水平的特殊幾何學和大腦組織的液體內容物來獲取THG的部分相匹配，提供了一種熒光對比度機制的替代方法。我們發現THG大腦圖像允許快速、無侵入性標記的神經元、白質結構、血管同時成像。而且，我們利用THG成像來引導微吸管指向活體組織中指定的神經元。這個工作是一個無標記活體大腦成像的主要步驟，并開啟了活體大腦中激光引導的微注射技術發展的可能性。
材料與方法
THG成像
對于THG成像實驗，我們使用了一臺商業化雙光子激光掃描顯微鏡(TrimScope, Lavision BioTec GmbH)。光源是一個光學參量震蕩器（Mira-OPO，APE），810nm泵浦光來自一個Ti：Sa鎖模激光器(Coherent Chameleon Ultra II)。使用一個20X，0.95N.A水浸物鏡(Olympus XLUMPFL-IR)將光聚焦到樣品上。使用epidetection幾何學描述THG實驗。使用分光鏡(Chroma T800lpxrxt)將背景散射THG光子從入射激光束中分離出來，用一個THG波段的帶通濾波器(Chroma HQ390-70X)過濾。檢測器是GaAsP高靈敏度光電倍增管(Hamamatsu H7422-40)，400nm處量子效率為25%。最高分辨率成像(1024×1024像素)的典型獲取時間為1.6s，我們用于目標定向實驗的512 X 512像素成像時間為0.6s。 為與前向端口比較，使用了一個定制的投射端口。這個端口使用了一個1.4N.A油浸物鏡，一個長波分光鏡（UQG optics)和一個400nm的相干窄帶濾波器。對于THG與SR-101聯合實驗我們用1200nm的OPO來同時產生兩種信號。使用一個594nm帶通和561nm隔斷的分光鏡將SR-101熒光從THG信號中分離。SR-101信號使用一個PMT檢測(Hamamatsu H6780-20)。Nile Red和THG成像也是由1200nm的OPO同步激發。在這個案例中THG信號由投射端口測量，Nile Red熒光通過一個593∕40 nm的帶寬濾波器檢測。對于THG和GFP聯合成像，用來泵浦OPO的Ti：Sa激光被調諧到970nm并耦合到顯微鏡中。組織塊的GFP和THG信號使用同一個檢測器連續測量。但使用一個不同的(561∕40 nm)帶通濾波器檢測GFP。使用顯微鏡軟件(Imspector Pro)獲取圖像并以16bit 的tiff格式存儲，圖像分析使用Image J(MacBioPhotonics)進行。