生物素標記探針:
1. 按如下順序加入反應物，溫和混勻，切勿渦漩
超純水 25μl
5×TdT Reaction Buffer 10μl
探針(1μM) 5μl
Biotin-N4-CTP 5μl
TdT (2U/μl) 5μl
37℃反應30分鐘
2. 加入2.5μl 0.2M EDTA終止反應；
3. 加入50μl 酚：氯仿，短暫渦漩，15000g離心2min，保留上層水相，－20℃保存；
4. 結合反應前等體積混合兩條標記引物，90℃退火引物，并自然冷卻至4℃，待用。
抽提核蛋白：
1. 2~3×106密度鋪60mm細胞培養板，培養約12h；
2. 移去細胞培養基，PBS洗細胞一次；
3. 加入1mL Buffer B 于培養板，將細胞刮下收集于1.5mL離心管；
4. 1000g 離心2min，吸去上清；
5. 加入160μl Buffer A，重懸沉淀，冰育20min；
6. 加入含2.5％NP-40的Buffer A，渦漩10s，4℃ 15000g 離心5min；
7. 吸去上清，加入40μl Buffer C，4℃渦漩25min，4℃ 18000g 離心5min；
8. 吸取2μl上清采用Bradford法測蛋白質濃度，其余儲存于-80℃。
配置非變性聚丙烯酰胺凝膠(以6％濃度為例)
5×TBE 1mL
30％Ac-Bi 2mL
40％Glycerin（甘油） 625μL
DDW （雙蒸水） 6.125mL
10%AP 150μL
10%TEMED 100μL
以預冷為4℃的0.5×TBE為電泳緩沖液，100V預電泳30-60min（時間不定，跑到溴酚藍占整塊膠的三分之二處）
EMSA（參考PIERCE公司試劑盒）
1. 特異性的證明
使用的探針序列需證明其是否與目的蛋白特異性結合，確定目的條帶的位置。
按照“步驟"中的體系，做以下四組平行結合實驗：
（在加入ddw，10×binding buffer，Poly(dI.dC)的基礎上)
1) 生物素標記的探針
2) 蛋白質粗提物
3) 蛋白質粗提物＋200倍濃度的非標記的同種探針（即冷探針）
4) 蛋白質粗提物＋200倍濃度的非標記的突變探針（可以設計多種突變類型的探針，看是否能競爭結合）
5) 蛋白質粗提物＋抗體
室溫反應10min，然后加入生物素標記的探針；
室溫繼續反應20min，做EMSA檢測。
結果分析，如果出現如下實驗結果
1) 顯示游離探針位置
2) 顯示游離探針位置和遷移帶位置
3) 只有游離帶，沒有遷移帶
4) 和2)帶型一致
則證明探針與目的蛋白為特異性結合。
步驟：
1. 按如下順序加入反應物，溫和混勻（20μl體系）
ddw ――
10×binding buffer 2μl
Poly(dI.dC) 1μl （以上文字已說明由公司定）
核蛋白粗提物 4－10μg（溫和混勻）
生物素標記的探針 0.5μl
室溫反應20min，加入6×Loading Buffer (TAKARA) 4μl，上樣10－20μl，100V電泳至溴酚藍于三分之二處。
2. 電轉前將尼龍膜浸泡于0.5×TBE至少10min
以預冷的0.5×TBE為電轉緩沖液100V轉膠于尼龍膜上，45min。
3. UV BOX下，以貼近膜一面面向紫外光源，以254nm激發光交聯15min（紫外交聯儀1200能量，照2次）
4. 加入25mLBlocking Buffer，以約70rpm在脫色搖床上封閉30min
5. 將SA-HRP以1:30000-50000稀釋于12mL Blocking Buffer，脫色搖床70rpm作用20min
(洗膜過程全部在脫色搖床上進行, 約100-140prm)
6. Buffer II 25ml, 5min
7. wash buffer 25ml 15min
8. Buffer III 25ml 5min×2次
9. 0.1%SDS in 2×SSC, 5min×2次
10. 0.1%SDS in 1×SSC, 10min×2次
11. 0.1%SDS in 0.5×SSC, 5min×2次
12. 將膜于濾紙稍適吸干，加入到以1:20稀釋的發光反應液(寧波奧唯)，作用1-5 min，將尼龍膜封于保鮮膜中（避免褶皺和氣泡的產生），暗室曝光1-5min，檢測信號。
使用此protocol效果圖
圖1. 用10ng/ml的mLT-?刺激MEF細胞，分別刺激0、15、30、60、120min，檢測NF-?B的量。（p：probe only. 只加入標記探針未加入核蛋白抽提物）