野菊花是傳統的清熱解毒藥,具有清熱解毒,疏風解熱的功效,臨床上常用于治療上呼吸道感染、急性扁桃體炎及流感、腮腺炎等等,而這些功效在現代醫學上均屬于炎癥反應范疇。現代藥理學研究也表明,野菊花具有顯著的抗炎作用。應用超臨界二氧化碳萃取技術提取野菊花中的有效成分,保留了野菊花中的揮發油、萜類、酚酸及黃酮類等熱不穩定性成分,且提取效率高,工藝穩定、環保。目前,野菊花超臨界二氧化碳萃取物已成功運用到藥物、功能食品、化妝品、日化產品上,但尚未有文獻報道相關的藥理活性。傳統的臨床應用,均是基于野菊花的抗炎活性。并且已在復方野菊花抗感軟膠囊應用,證實了具有較強的的抗炎活性。因此,本文擬對野菊花超臨界二氧化碳萃取工藝進行考察,聯合GC-MS和HPLC對其化學成分進行分析；并對其抗炎作用及機理進行研究。研究結果,有助于闡明野菊花超臨界二氧化碳萃取物的化學成分及其藥理活性,為其合理應提供科學依據。 方法： 1、野菊花超臨界二氧化碳萃取工藝考察與化學成分分析通過采取正交設計方法優化野菊花的超臨界二氧化碳萃取工藝。選取萃取壓力,萃取溫度,萃取時間作為考察因素,設計3個水平,以萃取率為指標,選用L9(34)正交表進行試驗。 分別用正己烷及70%甲醇對野菊花超臨界二氧化碳萃取物進行萃取,正己烷提取物用GC-MS進行分析,70%甲醇提取物用HPLC進行分析。 2、野菊花超臨界二氧化碳萃取物的抗炎活性研究 KM小鼠口服給予野菊花超臨界二氧化碳萃取物(40,80and120mg/kg),連續7天,每天1次,末次給藥1小時后,復制二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型,測定左右耳重量差異,耳廓腫脹度和耳廓腫脹抑制率,比較組間差異。 KM小鼠口服給予野菊花超臨界二氧化碳萃取物(40,80and120mg/kg),連續7天,每天1次,末次給藥1小時后,復制醋酸致小鼠毛細血管通透性模型,測定腹腔灌洗液的OD值差異,計算通透性增強度及通透增強抑制率,比較組間差異。 KM小鼠口服給予野菊花超臨界二氧化碳萃取物(40,80and120mg/kg),連續7天,每天1次,末次給藥1小時后,復制角叉菜膠致小鼠足腫脹模型,分別測定0,1,2,3,4,5,6h時腫脹足跖的體積,計算足跖腫脹度和腫脹抑制率,比較組間差異。 KM小鼠口服給予野菊花超臨界二氧化碳萃取物(40,80and120mg/kg),連續7天,每天1次,末次給藥1小時后,復制角叉菜膠致小鼠足腫脹模型,在造模后4h時,處死小鼠,取各組小鼠的足跖和肝臟。觀察足跖病理切片的差異；測定足跖組織中MPO, iNOS和COX-2的活性；測定足跖組織中MDA, TNF-a, IL-1β, IL-6, NO, PGE2和NF-κB的含量；測定肝臟組織中SOD, GPx和GRd的活性。 KM小鼠口服給予野菊花超臨界二氧化碳萃取物(40,80and120mg/kg),連續7天,每天1次,末次給藥1小時后,復制棉球致小鼠肉芽腫模型,稱量肉芽腫的重量,比較組間差異。3、野菊花超臨界二氧化碳萃取物對LPS誘導的急性肺損傷的影響 KM小鼠口服給予野菊花超臨界二氧化碳萃取物(40,80and120mg/kg),連續7天,每天1次,末次給藥1小時后,復制氣管滴注LPS復制小鼠急性肺損傷模型,觀察各組小鼠的生存情況,每6時觀察一次,并記錄死亡時間,考察120小時。 KM小鼠口服給予野菊花超臨界二氧化碳萃取物(40,80and120mg/kg),連續7天,每天1次,末次給藥1小時后,復制氣管滴注LPS復制小鼠急性肺損傷模型,觀察肺部組織病理切片的差異；測定肺濕/干重；測定肺泡灌洗液中蛋白的含量；計算肺泡灌洗液中細胞總數、中性粒細胞總數及巨噬細胞總數；測定肺組織中MPO, SOD, GPx及CAT的活性；測定肺組織中MDA, TNF-α, IL-1β及IL-6的含量；Western-blot法測定肺組織中TLR4/MyD88/NF-κB通路相關指標的蛋白表達水平。 4.野菊花超臨界二氧化碳萃取物的急性毒性的初步研究 采用半數致死量實驗和最大耐受量試驗相結合的方法,評價KM小鼠急性毒性實驗中提取物的最大給藥劑量和急性毒性反應 結果： 1、野菊花超臨界二氧化碳萃取工藝考察與化學成分分析 影響萃取率因素的主次關系是萃取壓力萃取溫度萃取時間。野菊花超臨界二氧化碳萃取的最佳工藝為萃取壓力25MPa,萃取溫度45℃,萃取時間3h,萃取物得率為5.12%。 GC-MS共鑒定了野菊花超臨界二氧化碳萃取物中的35種成分,主要成分有eucalyptol (3.091%), a-thujone (2.186%), β-thujone (2.169%), d-camphor (8.582%), cis-verbenol (4.720%), endo-borneol (7.845%), bornyl acetate (2.948%), thymol(3.071%), β-caryophyllen(3.336%), cis-β-farnesene(2.270%), α-curcumene (5.932%), caryophyllene oxide (8.460%), α-gurjunene (2.161%), aromandendrene (2.280%), α-bisabolol (2.289%), longifolenaldehyde (2.572%),a-bisabolol oxide (2.600%), a-linolenic acid (2.130%), ethyl octadec-9,12-dienoate (2.470%)。 HPLC共鑒定了野菊花超臨界二氧化碳萃取物中的五種成分,分別是：蒙花苷、綠原酸、金合歡素、木犀草素及木犀草苷。 2、野菊花超臨界二氧化碳萃取物的抗炎活性研究 在二甲苯致耳廓腫脹模型中,野菊花超臨界二氧化碳萃取物可以顯著減少造模小鼠左右耳重量的差值,從而減輕腫脹度。說明其對二甲苯所致的耳廓腫脹有抑制作用。 在醋酸致毛細血管通透性模型中,野菊花超臨界二氧化碳萃取物可以顯著減少造模小鼠腹腔灌洗液的OD值。說明其對醋酸所致的毛細血管通透性有抑制作用。 在角叉菜膠致小鼠足跖腫脹模型中,野菊花超臨界二氧化碳萃取物可以明顯減少造模小鼠足跖腫脹體積,從而減輕腫脹度；可以減少足跖組織病理形態的改變；可以抑制足跖組織中MPO, iNOS和COX-2的活性；可以降低足跖組織中MDA, TNF-α, IL-1β, IL-6, NO, PGE2和NF-κB的含量；可以抑制肝臟組織中SOD, GPx和GRd的活性。上述結果說明野菊花超臨界二氧化碳萃取物對角叉菜膠所致的足跖腫脹有抑制作用。 在棉球致小鼠肉芽腫模型中,野菊花超臨界二氧化碳萃取物可以明顯造模小鼠肉芽腫的重量,說明其對棉球所致的肉芽腫有抑制作用。 3、野菊花超臨界二氧化碳萃取物對LPS誘導的急性肺損傷的影響 在LPS誘導的急性肺損傷模型中,野菊花超臨界二氧化碳萃取物可以提高急性肺損傷小鼠的生存率；可以減輕肺組織病理切片的改變；可以減輕肺濕／干重；可以降低肺泡灌洗液中蛋白的含量：可以減少肺泡灌洗液中細胞總數、中性粒細胞總數及巨噬細胞總數；可以抑制肺組織中MPO, SOD, GPx及CAT的活性；可以降低肺組織中MDA, TNF-α, IL-1β及IL-6的含量；可以抑制肺組織中IκBα的磷酸化水平,上調細胞漿內p65的蛋白表達水平,下調細胞核內p65的蛋白表達水平,降低TLR4和MyD88的蛋白表達水平。 4.野菊花超臨界二氧化碳萃取物的急性毒性結果 無法進行半數致死量的研究,口服給予提取物的單次最大耐受量大于4g/kg。 結論： 考察了野菊花超臨界二氧化碳萃取的工藝,發現最佳工藝為萃取壓力25MPa,萃取溫度45℃,萃取時間3h,萃取物得率為5.12%。采用GC-MS和HPLC對野菊花超臨界二氧化碳萃取物的化學成分進行分析,鑒定了40個成分,主要為烯類、萜類、酚酸類及黃酮類成分；通過體內抗炎活性研究,證實了野菊花超臨界二氧化碳萃取物具有較強的抗炎活性。此外,通過LPS誘導的急性肺損傷實驗,證實了野菊花超臨界二氧化碳萃取物可提高急性肺損傷小鼠的生存率,對急性肺損傷小鼠具有良好的保護作用,其潛在機理可能是下調TLR4/MyD88/NF-κB通路的蛋白表達,抑制炎癥介質的釋放和提高抗氧化酶的活性。急性毒性研究也表明,野菊花超臨界二氧化碳萃取物的單次最大耐受量大于4g/kg,服用安全無毒。