凝膠色譜講義

第一章  前言

一、高聚物及多糖平均分子量及其分布

1、高聚物的平均分子量

除天然聚合物外，合成聚合物都是以單體為原料經過聚合反應而制得的。每個聚合物分子都是由數目很大的單體分子加成或縮合而成，所以合成聚合物的分子量比單體要大千百倍甚至成萬倍。另一方面，根據絕大多數的聚合反應機理預示，生成的聚合物的分子量是不均一的，也就是說每個聚合物分子可以由不同數目的單體分子聚合而成，所以各聚合物的分子量是不相等的，這種現象叫做聚合物的分子量的不均一性或多分散性。高聚物分子量的多分散性使分子量的表征比小分子要復雜一些，拿一個高聚物試樣來說，由于試樣內包含有許許多多個高分子，這些高分子的分子量可以分布在相當大的范圍內。例如，試樣中可以包含尚未聚合的單體、含二個、三個、四個、…單體的低聚物以及聚合度不同的高分子，對這樣一個多分散的體系來說，我們要表征它的分子量就需要用統計的方法，求出試樣分子量的平均值和分子量分布、由于應用統計方法的不同，即使對同一個試樣，也可以有許多不同種類的平均分子量；例如，某一個高聚物試樣中含有N1個分子量為M；的分子，N2個分子量為M2的分子，N3個分子量為M3的分子，……Ni-1個分子量為Mi-1的分子以及Ni個分子量為MI的分子，我們就可以根據定義算出它的各種平均分子量。下面是四種最常用的平均分子量定義：                                                     

這里：      

另外，粘均分子量：

很顯然，同一個試樣應用不同的統計方法所算出來的不同種類的平均分子量的數值是不同的。一般情況下，多分散樣品的平均分子量有以下次序：  Mz＞ Mw ＞ M η＞ Mn

2．高聚物的分子量分布

高聚物的分子量分布是指試樣中各種大小不等的分子量組分在總量中所占的各自的分量，它可以用一條分布曲線或一個分布函數來表示。例如，當我們知道高聚物試樣中分于量為M1、M2、M3、…、Mi各組分在總重量中所占的重量分數分別為 W1 、  W2、  W3 、…、  Wi 時，我們就可以用對應的 W和M作圖，得到分子量分布曲線。用重量分數（分子數分數也一樣）對分子量作圖的分布曲線，我們稱它為歸一化的分布曲線，因為曲線下面的面積總和等于1。分子量分布曲線有二種畫法：用重量分數w對M作圖的曲線叫微分分布曲線：用累積重量分布（I）對分子量M作圖的曲線叫積分分布曲線。由于高聚物的分子量一般在10⁴--10⁷范圍內，這是一個很大的數目，而相鄰組分間只差一個單體的分子量，所以可把分子量分布看作是一個連續變化的函數。

3、分子量分布寬度

試樣間分子量分布寬度的比較，最直接的方法是將實驗所得到的分子量分布曲線作對比。從歸一化的微分分布曲線或積分分布曲線都可以很方便地把定性和定量的差異檢查出來。這種用分子量分布曲線對比的方法在工廠定型產品的對比中很實用。還有一種更一般化的定量方法，那就是定義一個多分散程度的參數，如用多分散指數來表示。在文獻中曾經提出過不少表示多分散度的指數，其中最常用的是重均數均比，Mw／Mn。這個比值隨分子量分布寬度而變化。在單分散時，Mw／Mn等于1，隨著分子量分布變寬，MW／Mn值逐漸變大，目前實驗能夠合成的“單分散”試樣Mw／Mn值在1.02到1.l之間，而一般多分散試樣重均數均比值在1.5—3.0之間，而分子量分布比較寬的如聚乙烯，Mw／Mn值可以高達20—30或甚至更高。用Mw／Mn值來表示多分散度是很方便的，從實驗上來說既可以從兩種實驗方法測定兩種平均分子量來得到，也可以從實驗得到的分子量分布曲線分別計算Mw和 Mn來得到。在某些情況下，當分子量分布中高分子量尾端或低分子量尾端對性能影響比較大時，也可以用累積分布曲線中90％處的分子量與50％處的分子量的比值M90／M50，或50％處的分子量與10％處的分子量的比值M50/M10來表示多分散度。前者對高分了量尾端較敏感，而后者對低分子量尾端較敏感。選擇何種指數來表示分布寬度可以根據具體情況來決定。

二、高聚物分子量及其分布測定方法

聚合物溶液，特別是稀溶液，它的物理性質往往和聚合物的分子量有關。例如，溶液的滲透壓、沸點、冰點都與體系中的分子數目有關，因而由此可測聚合物的數均分子量：又如，溶液的光散射能力與體系中大分子的重量有關，因而由此可測重均分子量；溶液的粘度與體系中的分子數目、分子大小、分子形狀都有關，因而由此可測粘均分子量以及分子尺寸。各種聚合物分子量的測定方法及其適用范圍列于下表：

和測定分子量一樣，測定分子量分布也是最基本、最重要的實驗技術。分子量分布布測定的經典方法有沉淀分級法與溶解分級法，都是根據聚合物的溶解度對分子量的依賴性；凝膠色譜法是目前分子量分布測定的最理想的方法，是基于聚合物溶液中的溶質分子大小不同而達到分離之目的。

三、多糖類藥物分子量及其分布測定的意義和方法

多糖是由單糖縮合而成的鏈狀結構物質，是自然界中廣泛存在的一類生物大分子。由于多糖分布的廣泛性、結構的復雜性和生物作用的多樣性，使人們對它的藥用研究越來越重視，它將作為一類高效、低毒、新型藥物廣泛應用于人類疑難疾病的治療。

多糖是天然高分子中具有多分散性的聚合物，為了鑒定一種聚合物，首先必須測定其分子量與分子量分布，這是高分子化合物的最基本參數之一。多糖的分子量測定是研究多糖性質的一項重要工作。多糖的理化性質及活性與多糖的分子量及其分布有關，如右旋糖酐分子量為10萬～  20萬時能使血液中紅細胞聚集，而分子量為2萬～4萬時，不但不使紅細胞聚集，反而使已聚集的紅細胞解聚，所以不同分子量的右旋糖酐在臨床上有完全不同的應用，這些現象在羥乙基淀粉、羧甲基淀粉及一些果膠中也有類似的情況。又如低分子肝素是近十幾年發展起來的新一代肝素類抗血栓藥物，其抗血栓作用優于肝素，而抗凝血作用卻低于肝素，它具有生物利用度高，體內半衰期長，出血傾向小，口服易吸收等特點，目前已廣泛用于臨床。因此對于多糖類藥物，為了確保生產工藝的穩定性以及臨床用藥的安全有效性，分子量及其分布的測定是尤為重要的。

目前用于有機高分子分子量測定的許多物理方法，一般也適用于多糖。此外根據多糖的化學特性也另有一些化學方法。多糖分子量測定因其不均一性往往比較困難。通常所測的分子量一般只能是一種統計平均值。離心沉降法、光散射法和滲透壓法均可測定多糖的分子量。離心沉降法（沉降速度與沉降平衡法）測分子量要求粒子均勻、大小形狀相同，才能得到溶質與溶劑之間的清晰界面。多糖的不均性界面不易清晰。分子量較大的多糖不易制得真溶液。光散射法所測結果因凝集作用很易變大，且對于分子量一低于一萬的樣品測定誤差大。粘度法是實驗室常用且比較簡便的方法，但它是一種間接的且相對的分子量測定方法，它需要通過Mark－Houwink經驗公式換算才能得到粘均分子量。但是對于一種新的多糖其Mark- Houwink經驗公式是很難得到的。另外還有還原末端法、聚合度法等分子量測定方法，但都存在實驗繁瑣誤差大等缺點，不適合用于多糖類藥物質控。70年代以后，由于耐壓合成凝膠的出現，水相高效凝膠滲透色譜法（ HPGPC）開始用于多糖的分子量及其分布的測定，它具有快速、高分辨和重現性好等優點，是多糖類藥物分子量測定的較理想質控方法。