大腸桿菌誘變處理與營養缺陷型篩選

【實驗目的】

1.了解應用物理、化學因素對細菌進行誘變的方法。

2.初步掌握誘變產生營養缺陷型菌株的篩選與鑒定的技術。

【實驗原理】

在以微生物為材料的遺傳學研究中，用某些物理因素或化學因素處理細菌，可誘發基因突變。如果突變后喪失合成某一物質(如氨基酸、維生素、核苷酸等)的能力，不能在基本培養基上生長，必須補充某些物質才能生長，稱為營養缺陷型。實驗室獲得營養缺陷型菌株通過經過以下幾個步驟：誘變處理、突變型篩選、缺陷型檢出，缺陷型鑒定。

誘變處理首先要選擇誘變劑，誘變劑可分為物理和化學兩類。微生物誘變中最常用的物理誘變劑是紫外線。

進行誘變處理時為了避免出現不純的菌落，一般要求微生物呈單核的單細胞或單孢子的懸浮液，分布均勻。試驗表明處于對數生長期的細菌對誘變劑的反應最靈敏。

誘變處理必須選擇合適的劑量，不同微生物的最適處理劑量不同，須經預備實驗確定。物理誘變的相對劑量與三個因素有關：誘變源和處理微生物的距離、誘變源(紫外燈)功率、處理時間，往往通過處理時間控制誘變劑量。化學誘變劑的劑量也常以相對劑量表示。相對劑量與三個因素有關：誘變劑濃度、處理溫度和處理時間。一般通過處理時間來控制劑量，在處理前對誘變劑和菌液分別預熱，當二者混合后即可計算處理時間，可精確控制處理劑量。

經處理以后的細菌，缺陷型所占的比例還是相當小，必須設法淘汰野生型細胞，提高營養缺陷型細胞所占比例，濃縮缺陷型細胞。濃縮缺陷型的方法有青霉素法、菌絲過濾法、差別殺菌法、饑餓法等，這些方法適用于不同的微生物。細菌中常用的濃縮法是青霉素法，青霉素是殺菌劑，只殺死生長細胞，對不生長的細胞沒有致死作用。所以在含有青霉素的基本培養基中野生型能長而被殺死，缺陷型不能生長，可被保存得以濃縮。

檢出缺陷型的方法有逐個測定法、夾層培養法、限量補給法、影印培養法。這里主要以逐個測定法為例進行說明：把經過濃縮的缺陷型菌液接種在完全培養基上，待長出菌落后將每一菌落分別接種在基本培養基和完全培養基上。凡是在基本培養基上不能生長而在完全培養基上能長的菌落就是營養缺陷型。

經初步確定為營養缺陷型的菌株用生長譜法鑒定。在同一培養皿上測定一個缺陷型對多種化合物的需要情況。

【器材與試劑】

一、器材

離心機，紫外線照射箱，冰箱，恒溫箱，高壓滅菌鍋；三角燒瓶，試管，離心管，移液管，培養皿，接種針等。

二、試劑

肉湯液體培養基，ZE肉湯液體培養基，基本固體培養基，基本液體培養基，無N基本液體培養，2N基本液體培養基(成分及配制方法見后)。

20種基本氨基酸，7種微生素(硫胺素，核黃素，吡哆醇，泛酸，對氨基苯甲酸，煙堿酸，生物素)，嘌呤，嘧啶；亞硝酸鈉，青霉素鈉鹽，冰乙酸，乙酸鈉，氫氧化鈉，硫酸鎂，蔗糖；生理鹽水，0.1mol/L醋酸緩沖液(pH=4.0)，0.1mol/L NaOH。

混合氨基酸(包括核苷酸)共分7組：其中第Ⅰ到第VI組各有6種氨基酸(包括核苷酸)，每種氨基酸(包括核苷酸)等量研細充分混合；第VII組為脯氨酸，因容易潮解，故單獨組成。各組具體組成如下：

I. 賴氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、嘌吟 
      II. 組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、天冬氨酸(或甘氨酸)、嘧啶 
      III. 丙氨酸、甲硫氨酸，蘇氨酸、羥脯氨酸、甘氨酸、絲氨酸 
      IV. 亮氨酸、半胱氨酸，谷氨酸、羥脯氨酸、異亮氨酸、纈氨酸 
      V. 苯丙氨酸、胱氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、酪氨酸 
      VI. 色氨酸、嘌呤、嘧啶、絲氨酸、纈氨酸、酪氨酸 
      VII. 脯氨酸 
      混合維生素：把硫胺素、核黃素、吡哆醇、泛酸、對氨基苯甲酸、煙堿酸及生物素等量研細，充分混合即可。

【實驗步驟】

一、菌液制備

1.菌體的活化與培養

實驗前14～16h，挑取少量K12SF+菌，接種于盛有5ml肉湯培養液的三角瓶中，37℃培養過夜。第二天添加5ml新鮮的肉湯培養液，充分混勻后，分裝成2只三角瓶，繼續培養5h。

2 收集菌體

將兩只三角瓶的菌液分別倒入離心管中，3500rpm離心10min，棄去上清液，打勻沉淀，其中一管吸入5ml生理鹽水，然后倒入另一離心管，二管并成一管。

二、誘變處理

1.紫外線誘變法

(1)處理前先開紫外燈(15W)穩定30min。 
      (2)吸取菌液3ml于培養皿內，置于紫外燈下，距燈管28.5cm處；先連蓋在紫外燈下滅菌1min，然后開蓋處理1min(處理時間依70% 的殺菌率而定)；照射后先蓋上皿蓋，再關紫外燈。 
      (3)吸取3ml加倍肉湯培養液，注入處理后的培養皿中，37℃恒溫箱內避光培養12h以上。

2.亞硝酸誘變法

(1)吸取菌液1ml于離心管中，冰凍1h，制成靜止細胞。 
      (2)加入5ml 醋酸緩沖液(pH=4.0)，再加入13.8mg亞硝酸鈉，于37℃下誘變處理5～8min。 
      (3)加入0.1mol/L NaOH中和至pH=7.0，中止亞硝酸作用。

三、突變型的篩選與檢出

1.青霉素法淘汰野生型

(1)吸取5ml處理菌液于滅菌離心管中，3500rpm離心10min。 
      (2)棄上清液，加入生理鹽水，打勻沉淀，離心洗滌三次，加生理鹽水至原體積。 
      (3)吸取菌液0.1ml于5ml無N基本培養液中，37℃培養12h。 
      (4)加入等體積2N基本培養液，加入青霉素鈉鹽使最終濃度約為1,000單位/ml，置37℃恒溫箱中培養。 
      (5)培養12、16、22h時各別取菌液0.1ml，倒入兩個滅菌的培養皿中，再分別倒入經融化并冷卻至40℃～50℃的基本及完全培養基中，搖勻放平，待凝固后，置37℃恒溫箱中培養(在培養皿上注明取樣時間)。

2.逐個測定法檢出營養缺陷型

(1)以上平板培養36～48h后，進行菌落計數。選用完全培養基上長出的菌落數大大超過基本培養基的那一組，用接種針挑取完全培養基上長出的菌落80個，分別點種于基本培養基與完全培養基平板上，先點種基本培養基，后點種完全培養基，置于37℃恒溫箱中培養。 
      (2)培養12h后，選在基本培養基上不生長，而在完全培養基上生長的菌落，再在基本培養基的平板上劃線，置于37℃恒溫箱培養。24h后不生長的可能是營養缺陷型。

四、生長譜鑒定

1.突變菌株的培養與收集

(1)將可能是缺陷型的菌落接種于盛有5ml肉湯培養液的離心管中，37℃培養14-16h。 
      (2)培養后，3500rpm離心10min，倒去上清液，加生理鹽水，打勻沉淀，然后離心洗滌3次，最后加生理鹽水到原體積。

2.營養缺陷型的鑒定

(1)吸取經離心洗滌的菌液1ml注入一滅菌的培養皿中，然后倒入融化冷卻至40℃～50℃的基本培養基中，搖勻放平，待凝固，共做兩只培養皿。 
      (2)將2只培養皿底等分8格并標記(如右圖)，依次放 入混合氨基酸(包括核苷酸)、混合維生素和脯氨酸(加量要很少，否則會抑制菌的生長)，然后置于37℃恒溫箱培養24～48h，觀察生長圈，當某一格內出現圓形混濁的生長圈時，即說明是某一氨基酸、維生素或核苷酸的缺陷型。

注意事項

皮膚曝露在紫外線下可致皮膚癌；眼睛最易受到紫外線損傷，導致短期甚至永久失明。因此，操作時要有相應的防護措施。亞硝酸也是較強致癌物質，請注意安全與環境保護。各種器具、培養基及直接加入培養基中的試劑均需滅菌。