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  • 發布時間:2020-02-03 21:05 原文鏈接: 新型高效方法應對植物組培過程中的污染問題

    植物組織培養是20世紀初發展起來的一門新興技術,隨著這項技術的日益完善,其應用也越來越廣泛。但是在組織培養過程中,常常會遇到污染問題使實驗無法進行下去,甚至導致整個實驗失敗,給科研和工廠化生產帶來損失。

    污染是指在植物組織培養過程中,培養基和培養材料滋生雜菌,最終導致培養失敗的現象。常見的污染類型包括:由霉菌引起的真菌性污染、多由外植體帶菌引起的細菌性污染、長期多次繼代引起的內生菌污染以及農桿菌污染等。面對植物組培污染問題,我們通常采取在培養基中加入適量的抗生素(如青霉素、鏈霉素、氯霉素等)來抑菌。但是抗生素一般不穩定,遇酸、堿或加熱都易分解而失去活性。而且單一抗生素抑菌容易產生抗藥性,一旦停止使用,污染率就會顯著上升。同時,高濃度的抗生素會影響植物的生長。


    圖片1

    為解決上述問題,我們推薦專業植物組培高效廣譜性抗菌劑PPM?,它可以有效預防和清除由于空氣、滅菌不徹底、交叉污染、外植體消毒等各種原因導致的植物組培苗的真菌、細菌、內生菌和農桿菌污染。可以加入培養基高溫滅菌;而且在合理使用劑量下,不會對植物的生長產生任何影響。

    使用方法如下:

    1、常規污染預防用量:

    一般推薦使用濃度為0.05%-0.2%(1L培養基中加入0.5-0.75ml PPM?);愈傷增殖, 器官形成,胚性組織發育等使用濃度為0.05%-0.075%。

    2、植物內生菌污染處理:

    種子:PPM?不推薦用于直接處理含有大量的細菌或真菌孢子的種子滅菌;對于種子離體萌發,建議先采用傳統方法消毒,然后置于含 2-3%PPM?的全培養基礎鹽溶液中,輕輕攪拌4-12小時,此過程千萬不能添加Tween20和調節pH,處理完成以后直接插入含有 PPM?(草本植物0.05-0.1%,木本植物0.2%)的培養基里進行培養。

    外植體::以 1cm 外植體為例,將外植體置于含 4-5%PPM?的全培養基礎鹽溶液中,輕輕攪拌4-12小時,此過程千萬不能添加 Tween20和調節pH,處理完成以后直接插入含有PPM?(草本植物 0.05-0.1%,木本植物0.2%)的培養基里進行培養。

    塊莖,球莖和鱗狀物的觀賞植物樣本:將其整體放入消毒劑中攪拌消毒處理以后, 用水沖洗干凈,將材料切成薄片,置于含 4-5%PPM?的全培養基礎鹽培養液中,輕輕攪拌4-12小時,此過程千萬不能添加Tween20 和調節pH,處理完成以后無需沖洗直接插入含有 0.1-0.2%的PPM?的培養基里進行培養。

    3、如果厚的外植體、污染嚴重的植株、種子等樣本經過以上處理仍得不到理想效果,可嘗試以下操作:

    將材料浸泡在水中持續攪拌處理(松軟組織攪拌1小時,硬實組織攪拌2小時)

    將材料在含50%的PPM?全培養基礎鹽溶液中攪拌處理5-10分鐘,此過程千萬不能添加 Tween20 和調節pH

    無需沖洗,將處理過的材料直接加入到培養基中即可。對于真菌污染,可在培養基中加入適當濃度的PPM?。對于真菌細菌混合性污染,建議在培養的第一個月的培養基中加入0.05%-0.2%的PPM?

    4、嚴重污染材料污染去除與搶救(重污染不超過一周)

    將污染的材料至于流水中用軟刷刷洗,然后置于含50% PPM?的無菌水溶液中攪拌5-15分鐘;對于細菌或者混合性污染,建議使用 100% PPM?與 0.6g/L 的檸檬酸無菌水溶液按 1:1 混合的低 pH(2.8-3.2)的酸性溶液處理

    處理后的材料無需清洗,直接插入含0.05%-0.25的PPM?的培養基中培養至少一個月以上,其中前10天需要弱光培養

    5、農桿菌的去除

    共培養以后,將樣本用無菌水清洗,然后將樣本浸沒在 100% PPM?(補充4X的培養基鹽溶液)中處理2分鐘,取出后用無菌紙吸干后并置于常用抗性培養基中培養,3 周后,更換到只含有0.05%-0.075% PPM?(無常用抗生素)的培養基中培養。


    圖片2

    注意事項:

    在所有 PPM?消毒處理外植體的過程中,盡量保證容器的體積足夠大,并使外植體材料所有面積與含PPM的處理溶液充分接觸,以保證消毒效果;

    如果外植體出現高度氧化現象,不要扔棄,大約50%的外植體在 4-6 周內即可恢復

    50% PPM? 的處理溶液可以重復使用但是不推薦,因為使用次數和效果受外植體的體積與接種密度的影響。將50% PPM?的處理溶液保存在4oC可適當延長其活性,一般可使用不超過10次。如果必要,建議配制2份50% PPM?溶液,一份用于外植體消毒內生菌污染,另一份用于消除“培養過程中”的輕度污染材料搶救,第二份溶液在每次處理過后需要用 0.2mm濾器過濾

    如果50%PPM?溶液處理效果不理想,可采用100%PPM?溶液進行處理,處理方法相同,但使用次數不得超過10次。


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