單細胞精度解析人類T淋巴細胞起源及胸腺器官發生

　　T淋巴細胞是宿主適應性免疫系統中最重要的免疫細胞之一，在抵抗病原入侵、維持機體穩態以及抗腫瘤等方面起到不可或缺的作用【1,2】。胸腺是T淋巴細胞發育的必需場所【3】。胎肝或骨髓來源的胸腺定植祖細胞（thymus seeding progenitor, TSP）遷移定植到胸腺后，即為早期胸腺祖細胞（early thymic progenitor，ETP）【4】。ETP在胸腺中經過增殖、特化、T細胞受體重排、陽性選擇和陰性選擇，形成成熟的胸腺細胞即初始T淋巴細胞輸出至外周【5】。在該過程中，包括上皮細胞及間質細胞在內的胸腺基質細胞對于胸腺細胞的分化成熟發揮了重要作用【6】。由于技術手段制約以及樣品稀缺，對于人類胚胎最早T淋巴細胞發生的認識相當匱乏。此外，精準、深入解析人類T淋巴細胞的起源及發育規律，對于指導T淋巴細胞體外再生必將提供重要的理論基礎。

　　2019年10月8日，四川大學胡洪波研究組、解放軍總醫院第五醫學中心劉兵研究組與暨南大學基礎醫學院蘭雨研究組合作在Immunity雜志在線發表了題為 Single-cell RNA Sequencing Resolves Spatiotemporal Development of Pre-thymic Lymphoid Progenitors and Thymus Organogenesis in Human Embryos 的研究成果。該研究在國際上首次通過單細胞轉錄組測序構建了人類胚胎早期T淋巴細胞發育以及胸腺器官發生的分子圖譜。

　　作者首先針對人類胚胎胸腺器官發生階段（8-10周）的細胞，利用高通量單細胞轉錄組測序，鑒定出造血、上皮、間質、內皮共四類主要細胞群體。進一步將造血細胞分為10個亞群（圖1），分別為：三個ETP亞群，包含embryonic ETP、fetal ETP1和fetal ETP2；三個T細胞前體亞群，包括 T precursor、 T precursor 1和 T precursor 2；以及固有淋巴細胞、巨噬細胞、樹突細胞和肥大細胞亞群。通過比較embryonic ETP（主要來源于8周）和fetal ETP（主要來源于9、10周）的差異表達基因，推斷在胸腺內血管形成（8周）前后【6】，造血祖細胞可能通過不同的方式遷入胸腺。通過體外培養，證實CD7+ETP（Lin-CD45+CD34+CD1a-CD7+）除了具有T細胞潛能之外，仍具有髓系、B和NK的多系分化潛能，這與成體CD7+ETP僅具有T和NK的分化潛能不同【7】。

圖1. 人胚胸腺中的造血細胞群體及特征基因

　　為了追溯胸腺中ETP的起源，作者進一步將胸腺ETP與不同發育階段生血位點（主動脈-性腺-中腎區）、造血位點（胎肝）和循環血中的淋系祖細胞（轉錄組表達IL7R的群體）進行聯合分析（圖2），發現ETP與相近發育階段胎肝中淋系祖細胞最為相似。ETP可以根據與胎肝中淋系祖細胞的相似性重新分為兩個亞群：更相似者具有更靜息的細胞周期特征（TSP-like ETP），而另一個亞群處于更活躍的細胞周期狀態（proliferating ETP）。對于胎肝而言，與TSP-like ETP在發育軌跡上重疊的那部分淋系祖細胞則被定義為TSP。胎肝中其他淋系祖細胞高表達B淋系相關基因，如CD79A, CD79B和VPREB3，提示B淋巴細胞分化潛能。既往研究表明，在早于胸腺器官發生的胚胎發育階段，主動脈-性腺-中腎區就存在具有T淋巴細胞分化潛能的祖細胞【8,9】。本研究中，作者進一步在轉錄組水平實現了對于早在5周左右的主動脈-性腺-中腎區淋系祖細胞的群體捕獲和分子特征分析。

圖2. 轉錄組水平識別胸腺最早的 ETP以及胎肝TSP

　　此外，作者還深入分析了人胚胸腺中和 T淋巴細胞早期特化過程中的不同基因調節模式；解析了胸腺上皮細胞（Thymic epithelial cell, TEC）早期分化事件，發現皮質TEC的成熟早于髓質 TEC。為了闡明胸腺中微環境細胞成分對造血細胞的潛在調控作用，作者利用受配體分析預測了上皮、間質、內皮細胞群體與不同造血細胞群體之間潛在的相互作用；利用多色免疫熒光證實間質細胞分泌產生IGF2，可能調控表達IGF1R的造血祖細胞定向T淋巴細胞發育【10】。

　　綜上所述，該工作精細解析了人胚胸腺器官發生階段ETP的分子特征異質性，鑒定出最早定植胸腺的ETP及其在胎肝中的前體細胞TSP；在胸腺器官發生之前的主動脈-性腺-中腎區，實現了對淋系祖細胞在轉錄組水平的捕獲和分析；解析了人胚胸腺中T淋巴細胞以及TEC早期分化事件；預測了T淋巴細胞發育過程中重要的異源細胞間相互作用。這些發現為人類早期T淋巴細胞發生的調節機制研究以及T淋巴細胞體外再生策略研究提供了重要的理論支撐和數據庫資源（圖3）。

圖3. 示意圖展示單細胞解析人類胚胎早期T淋巴細胞發生

　　據悉，胡洪波研究員、劉兵研究員和蘭雨研究員為該論文的通訊作者。曾揚博士、博士研究生劉晨、公彥棟、柏志杰、侯思元為該論文的共同第一作者。解放軍總醫院第五醫學中心婦科卞麗紅主任和馬春雨醫生為該工作提供了大力支持。

　　專家點評

　　魯林榮（浙江大學醫學院／浙江大學愛丁堡大學聯合學院）

　　眾所周知，T細胞在人體免疫反應中起核心作用。澳大利亞WEHI Institute的生物學家Jacques Miller在1961年發現T細胞在胸腺中發育成熟，并因此在2019年分享了拉斯克基礎醫學研究獎【11,12】。我們對T細胞在胸腺中發育的各個階段步驟、關鍵的檢查點及其所需要的信號已經有了充分的研究【13】。但相比之下，我們對胸腺本身的發育及早期胸腺祖細胞的來源、特征、分類及分化過程知之甚少【14】。

　　此項研究，首次利用了單細胞測序方法分析了不同發育階段人體胚胎和胎兒來源的胸腺，繪制了人體胸腺發育過程中完整的細胞圖譜，闡明了早期胸腺祖細胞的多樣化來源和分化途徑。此項工作的主要研究發現包括：1）通過對比胸腺及胎肝和AGM區細胞，鑒定了胸腺祖細胞的兩種不同來源，首次在人胚AGM區發現了一種不同類型的胸腺前淋巴祖細胞；2）明確了早期胸腺祖細胞在胸腺發育過程中由“TSP-like ETP”開始，經由具有較高增殖能力的“增殖ETP”發育到“EPT2”的發育和譜系定向途徑，確定了這些細胞階段的分子特征；3）通過基因表達指紋明確了 and T細胞分化的途徑和基因表達特征；4）揭示了胸腺上皮細胞，特別是皮質胸腺上皮細胞cTEC早期發育和成熟過程，明確這些過程的分子特征，并在此基礎上分析了胸腺發育過程中這些細胞與早期胸腺祖細胞間的信號互作。

　　我覺得這項工作的重要意義還體現在它還給胸腺T細胞發育研究帶來了一些有趣的問題。譬如，胸腺發育領域內長期存在一個重要的問題：即 T和B細胞都由造血系統中淋巴細胞前體細胞發育而來，那么早期胸腺祖細胞是先得到定向T細胞發育信號來指導它們向胸腺遷移，還是淋巴細胞前體細胞隨機向外遷移，并到達胸腺才確定它們的定向發育方向？之前的研究表明，ETP來源于lymphoid-primed multipotent progenitors （LMPPs），而LMPPs細胞具有向T和B細胞分化的潛能【15】。另有實驗表明，胸腺ETP細胞仍具有向B細胞分化的能力，這一發現顯然支持了后一種可能【16】。但此項研究表明，人胎肝存在的lymphoid progenitors可根據其分子特征，一部分細胞的分子特征與胸腺中TSP-like ETP重合，而另一部分和TSP-like ETP不重合的細胞則具有更多B細胞特征性基因。這一結果顯然支持第一種可能，即胸腺前體細胞在造血器官中已經開始了向T或B細胞定向選擇，定向T細胞的胸腺祖細胞才是向胸腺遷移的細胞。

　　這項工作還有很重要的實踐指導意義：胸腺發育是人體內特化最明顯的發育過程之一。迄今為止，我們還無法在體外完全重構胸腺發育和實現有功能的T細胞分化【17】。因此對人體內胸腺發育過程中細胞特性的研究，將有助于我們獲得足夠的相關信息，指導我們克服這一技術難題。這一難題的解決，將有望實現為免疫缺陷病人、免疫功能減退病人，和腫瘤病人重建人體免疫功能，幫助他們抵御感染性疾病和腫瘤。

　　專家點評

　　溫子龍（香港科技大學生命科學部）

　　獲得性免疫是脊椎動物進化出的復雜且獨特的免疫系統，與先天免疫系統相比具有更高的特異性和更強的防御能力。T淋巴細胞作為后天免疫細胞的一種，既承擔細胞免疫任務，也調控和介導體液免疫，是整個獲得性免疫系統的核心成分。T淋巴細胞與多種人類疾病的產生和治療都有密切關系，尤其是近年來，免疫檢查點阻斷（immune checkpoint blockade）增強T細胞功能以及表達嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）的T細胞已被FDA批準用于治療多種類型的癌癥【18,19】。因此，T細胞的發育和功能一直是基礎科學和臨床醫學研究的焦點。臨床上對于T細胞的迫切需求促使眾多科研團隊嘗試通過體外培養誘導分化的方法獲得具有功能的T細胞【20-22】，然而通過體外誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）分化形成T細胞-這一最具臨床應用前景的策略-目前尚未成功。對于這一難題的攻克，有賴于對胚胎時期T細胞產生、發育和分化過程更為深入的理解，這包含了兩個方向的研究，其一是T細胞本身的發育，其二是T細胞發育分化所必需的器官-胸腺（Thymus）-的發生和發育。

　　胚胎發育早期移居至胸腺的T淋巴祖細胞（thymus seeding progenitors，TSPs）及其在胸腺內初步發育形成的早期祖細胞（early thymic progenitors, ETPs）數量極其稀少，且由于小鼠胚胎在子宮內發育，使得T細胞和胸腺的早期發育過程難以直接觀察。因此，在以往通過傳統技術手段開展的研究中，人們對于小鼠胚胎中TSPs、ETPs以及胸腺上皮細胞的分子特征和發育過程的理解非常有限，在人類胚胎中更是缺乏相關研究。幸運的是，近年來單細胞轉錄組測序技術的飛速發展，使得探索細胞群體內部的異質性和鑒定稀有細胞種類的分子特征成為可能。

　　解放軍總醫院第五醫學中心劉兵課題組與暨南大學基礎醫學院蘭雨課題組在近年來的研究工作中建立了先進的高通量測序分析技術平臺，并利用此優勢開展了多項胚胎造血研究，包括對于人類胚胎早期造血干細胞發生全過程的深度解析【23】等杰出工作。

　　近日，四川大學生物治療國家重點實驗室胡洪波課題組聯合劉兵團隊和蘭雨團隊，在針對人類胚胎時期T細胞起源和發育的研究中又做出了重大發現，三個課題組共同合作的題為 Single-Cell RNA Sequencing Resolves Spatiotemporal Development of Pre-thymic Lymphoid Progenitors and Thymus Organogenesis in Human Embryos 的文章發表在Immunity上。

　　他們利用10x Genomics Chromium System和 Single-Cell Tagged Reverse Transcription RNA Sequencing（STRT-seq）高通量單細胞轉錄組測序技術，對不同發育階段的人類胚胎分別取樣，對多個關鍵的造血組織進行了系統分析。他們發現人類胚胎中TSPs和ETPs在不同發育階段具有多個不同亞群，每個亞群具有各自獨特的分子特征。通過對于不同亞群的聚類分析和分子特征比對，發現在人類胚胎中，最早移居至胸腺的ETPs和胎肝中的TSPs具有相同的分子特征，提示人類胚胎早期進入胸腺的ETPs可能經歷胎肝內的發育過程。他們還發現，早在胸腺開始形成之前，人胚AGM區-負責形成造血干細胞的主要組織之一-就已經出現了一批IL7R+ T淋巴祖細胞。此外，他們對TECs的分子特征進行了系統分析，發現人胚TECs包含多個不同的亞群。對不同發育階段的TECs的基因表達水平分析發現，胸腺皮質上皮細胞抗原遞呈相關基因的表達早于胸腺髓質上皮細胞的相關基因，提示人類胚胎中胸腺皮質的成熟可能早于髓質。另外，他們通過對測序細胞進行配體-受體互作分析，發現TECs可能與T淋巴祖細胞和T淋巴前體細胞之間存在多種配體-受體介導的相互作用，提示TECs可能參與調控T細胞在胸腺內的的遷移和發育過程。

　　他們這一研究發現與先前基于小鼠模型的多個研究結論，以及人類胚胎中的轉錄組測序數據高度契合，證明利用小鼠模型進行T細胞發育和胸腺發育相關研究的可靠性及其對臨床醫學的重要指導價值。更重要的是，他們的此項工作填補了人類胚胎中T淋巴細胞發育和胸腺器官形成在轉錄組水平分析的空白，其測序工作涵蓋人類胚胎多個發育階段的多個造血組織，為后續的人類T細胞相關研究提供了非常全面和寶貴的數據資料，是一個里程碑式的工作。他們獲得的數據將對體外誘導T細胞分化以及相關的T細胞造血再生等醫學研究領域提供重要的基礎支撐。