染色體G顯帶核型分析

核型分析簡介

染色體是細胞分裂期高度凝集的 DNA 蛋白質纖維，是間期染色質結構緊密盤繞折疊的結果。核型是指一個體細胞內的全部染色體按其大小、形態特征排列起來構成的圖像。將待檢細胞進行染色體數目、形態結構分析，確定其核型是否與正常核型一致，稱為核型分析。染色體核型分析，是遺傳學科學研究和輔助臨床診斷的重要手段之一，是分析染色體易位、缺失，診斷各種遺傳病變的關鍵指標。

染色體核型分析實驗是選擇增殖旺盛期的細胞進行秋水仙素處理，使細胞分裂停止在中期，以獲得足夠量的分裂期細胞，經低滲、固定、制片、染色，在顯微鏡下觀察。制備的染色體標本，未經特殊處理，直接染色后鏡下觀察進行核型分析的過程稱為染色體非顯帶核型分析。染色體顯帶核型分析則是染色體標本經顯帶技術處理，使染色體沿縱軸上顯示出一定數量的、著色程度不同的、寬窄不等的明暗相間的帶紋。每條染色體都有獨特而恒定的帶紋，主要取決于 DNA、蛋白質及染料三者的相互作用。顯帶技術不同，染色體上顯示出的帶紋也不同。染色體顯帶技術包括 G 顯帶、Q 顯帶、R 顯帶和 C 顯帶等。G 顯帶技術是將染色體標本經胰蛋白酶消化后，再以吉姆薩（Giemsa）染色而顯帶。其所顯示的染色體帶紋清晰，普通顯微鏡下可以分辨，標本可長期保存，因此被廣泛應用。

實驗步驟（以下以貼壁培養細胞為例）

一、實驗準備

1）細胞完全培養基：根據細胞類型和實際需要確定

2）細胞消化液：0.25% Trypsin-EDTA

3）磷酸緩沖液（PBS）：pH7.4

4）秋水仙素（或者秋水仙胺）溶液：20 μg/mL

5）低滲液：0.075 M KCl 溶液

6）固定液（新鮮配制）：甲醇：冰醋酸 = 3：1

7）Giemsa 染色液：先配置 1% Giemsa 原液（以甘油，甲醇配制），再以 PBS 稀釋 10 倍后使用。

8）胰酶溶液：0.25% Trypsin

9）乙醇：95% 乙醇（AR）

10）其他耗材：載玻片、無紡布等。

二、染色體標本制備

1）載玻片清洗：將載玻片逐片放入超聲波清洗器內超聲 30 min，然后用自來水將載玻片進行徹底沖洗，烘干。逐片放入次強酸清洗液中浸泡約 24 h。取出后用自來水徹底沖洗，然后用純水徹底沖凈，然后放入 95% 乙醇內保存備用（需密封）。使用前可用無紡布將載玻片擦干，置于- 20℃ 預冷備用。

2）細胞培養：細胞正常培養，觀察細胞生長狀態，接種至 6 孔培養板，待其生長至對數生長期（融合度 70%～80%）進行實驗。

3）秋水仙素處理：吸去培養基，加入含有秋水仙素（終濃度 0.2 μg/mL）的新鮮培養基，繼續于 37℃ 培養 2 小時。培養結束后，常規消化細胞，離心去上清液，重懸細胞并輕輕吹散均勻。

4）低滲處理：低滲液于 37℃ 預熱，然后逐滴滴加 3 mL 低滲液，并將細胞均勻分布于懸液中，再逐滴滴加 5 - 7 mL 低滲液，輕輕顛倒離心管至水平 2 次，放至 37 ℃ 水浴作用 15 分鐘。

5）預固定：加入新鮮配制的固定液約 200 μL，預固定 2 - 3 分鐘；800 rpm 離心 8 分鐘。

6）固定：A．去上清，敲打管底以剩余溶液使細胞充分重懸，確保細胞成單個分散狀態；B．沿管壁逐滴滴加 3 mL 固定液，用槍輕輕將細胞吹散，再逐滴加入 5 - 8 mL 固定液，固定 40 分鐘；C．800 rpm 離心 8 分鐘，敲打管底使細胞充分重懸，確保細胞成單個分散狀態。如上述加入固定液重復固定細胞 2～3 次；D．剩余 0.5 - 1 mL 固定液，用槍輕輕吹散細胞。

7）制片：吸取細胞懸液，滴至預冷的載玻片上，將載玻片掠過酒精燈幾次，室溫下干燥。在顯微鏡下觀察，如果細胞能均勻的鋪展，中期相不重疊，則用同樣細胞濃度樣品多制備幾份樣品。否則要進一步稀釋細胞懸液，或者調整滴片高度，以達到滿意的鋪片效果。

8）染色：取出玻片，滴加 Giemsa 工作液，完成覆蓋即可，染色 20～30 分鐘；自來水沖洗終止染色，放入 35 ℃ 烘干。

9）封片：以封片劑封片，以備長期保存。

10）鏡檢觀察：先用低倍鏡做全面檢查，再換至高倍鏡，以油鏡觀察并拍照。每個樣本至少選取 30 個染色體組進行后續計數分析。

三、G 顯帶

1）胰酶工作液準備：以 PBS 將 0.25% Trypsin 稀釋 10 倍（以染缸準備 50 mL 工作液），置于 37℃ 水浴鍋中預溫。

2）制片老化：前述制備好的未染色的玻片在烘箱中 70℃ 烘烤 2 小時進行老化處理。

3）胰酶消化：將玻片置于胰酶工作液中處理 2 - 3 分鐘，輕輕搖動，然后在 PBS 中漂洗玻片。

4）染色：Giemsa 染色同前。

5）封片：同前。

6）鏡檢觀察。

四、核型分析

1）軟件分析：常見的分析軟件包括 Videotest 染色體核型分析軟件、MetaScan Karyotyping System PathfinderTM KARYOTM 模塊、IMSTAR 全自動智能染色體核型分析系統 Pathfinder Karyo 系列等。

2）人工分析：選取染色體分散良好的圖片至少 30 組，先計數統計。再根據同源染色體大小、形狀、帶型等相似的特點，將染色體進行配對。可先以圖像處理軟件將每條染色體剪切編號，擺正位置，然后根據各組染色體的帶型特點進行配對，可以 imageJ 等軟件計算長、短臂長度輔助進行配對。

正常男性 G-顯帶核型示例

五、注意事項

1. 細胞狀態。應該選取生長狀態良好的細胞進行實驗，生長狀態差的細胞，比如老化的間充質干細胞等，應在實驗前通過觀察即排除。

2. 染色體標本制備。針對不同的細胞，所使用的秋水仙素的用量和作用時間，低滲和固定的處理時間，滴片時細胞的濃度，滴片高度及玻片的預處理，均會對制片有所影響。因此需要根據實際情況做調整。

3. G 顯帶過程中，胰酶作用時間、溫度、pH 值等均會對顯帶帶來影響，應避免過長或過短消化。

4. 核型的最終分析，即便是使用軟件進行分析，也依然需要熟練技術人員的核對。每對染色體的不同顯帶特點，需要技術員長期大量的經驗積累。對異常染色體組的核型分析，尤其需要注意選擇多個圖形進行分析后，再做出結論。