1.引物是如何合成的？
目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種, 主要都是由ABI/PE 公司生產，無論采用什么機器合成，合成的原理都相同，主要差別在于合成產率的高低，試劑消耗量的不同和單個循環用時的多少。
亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯以及起始反應物比較穩定的特點。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相鄰的核苷酸通過3'→5'磷酸二酯鍵連接。
第一步是將預先連接在固相載體CPG上的活性基團被保護的核苷酸與三氯乙酸反應，脫去其5'-羥基的保護基團DMT，獲得游離的5'-羥基；
第二步，合成DNA的原料，亞磷酰胺保護核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3'端被活化，5'-羥基仍然被DMT保護，與溶液中游離的5'-羥基發生縮合反應。
第三步，帶帽(capping)反應，縮合反應中可能有極少數5'-羥基沒有參加反應(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續發生反應，這種短片段可以在純化時分離掉。
第四步，在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉變為更穩定的磷酸三酯。
經過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙酸脫去它的5'-羥基上的保護基團DMT，重復以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。
通過氨水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來，通過OPC, PAGE等手段純化引物，成品引物用C18濃縮,脫鹽，沉淀。沉淀后的引物用水懸浮，測定OD260定量，根據定單要求分裝。
2.引物純化方式有哪些，如何選擇？
◆ C18柱脫鹽：有人稱其為簡易反相柱，它對DNA有特異性的吸附，可以被有機溶解洗脫，但不會被水洗脫，所以能有效地去除鹽分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。實際上，它是一種脫鹽的作用。這種方法一般不會對普通PCR反應產生影響。對于需要用于測序、克隆的引物不能使用這個級別。
◆ OPC純化： OPC純化是根據DNA保護基（DMTr基）和Cartridge柱中樹脂間的親合力作用的原理進行純化目的DNA片段。OPC法純化的DNA純度大于95%。適用于40mer以下引物的純化。
◆ PAGE純：PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對DNA片段進行分離，然后從凝膠中回收目的DNA的方法。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法，純化后的DNA純度大于95%，對長鏈Oligo DNA (大于50mer)的純化特別有效。
◆ HPLC純化：HPLC純化是使用高效液相色譜的原理，對DNA片段進行純化。純度可以大于99%。主要用于短鏈和修飾引物的純化。該法的弱點是成本較高，批量生產效率不高。
3.引物的OD數如何定量？
答：引物合成引物OD數是這樣測定的：用紫外分光光度計，波長260nm，石英比色杯，光程為1厘米，測定溶液的光密度。測定時溶液的光密度最好稀釋到0.2-1.0之間。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，用1ml水稀釋測OD值。需要根據稀釋倍數換算出母液的OD值。
4.需要什么級別的引物？
答：引物常用的純化方式C18脫鹽，OPC純化，PAGE純化，HPLC純化。根據實驗需要，確定訂購引物的純度級別。
應用 引物長度要求 純度級別要求
一般PCR擴增 < 45base OPC
>45 base PAGE
診斷PCR擴增 < 40base OPC, PAGE
DNA測序 20base左右 OPC
亞克隆，點突變等 根據實驗要求定 OPC, PAGE，HPLC
基因構建（全基因合成） 根據實驗要求定 PAGE
反義核酸 根據實驗要求定 PAGE
修飾引物 根據實驗要求定 PAGE, HPLC
5.最長可以合成多長的引物？
答：引物越長，出現問題的概率就越大。我們合成過120base的引物，但是產率很低。除非需要，建議合成片段長度不要超過80mer,按照目前的引物合成效率，
80mer的粗產品，全長（還不一定正確）引物的百分比不會超過40%，后續處理還有丟失很多，最后的產量是很低。
6.需要合成多少OD數？
答：根據實驗目的確定。一般PCR擴增，2 OD引物，可以做200-500次50ul標準PCR反應。如果是做基因拼接或退火后做連接，1 OD就足夠了。但是有些研究人員，就做幾次PCR，但是卻要5-10 OD。做全基因構建的引物都比較長，但是我們有些研究人員也要求高OD數。片段越長, 最后全長得率就越低，出錯的幾率就越大。超出需要之外的OD數要求，其實也是對社會資源的一種浪費，同時也從一個側面反映了部分研究人員，特別是新手的自信心不足，總覺得需要重復多次才能成功。
7.如何檢測引物的純度？
答：實驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進行電泳，一定時間后(約2-3小時)，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。如果條件許可，也可以用EB 染色或銀染方式染色。
8.如何計算引物的濃度？