Nature子刊：新型單細胞測序方法可有效追蹤癌癥免疫細胞

　　近年來，隨著精準醫療的發展，癌癥治療已經取得了長足的進步，其中借助免疫系統開發的多種治療方法被人們寄予厚望。雖然部分治療方法在臨床治療中已經獲得一定的成功，但大多數只對部分患者有效，并且還會導致耐藥、超進展以及免疫相關嚴重不良反應等問題。因此，了解免疫系統在癌癥治療中的表現，準確篩選最有可能獲益的患者人群，已成為當前癌癥治療實踐中的一項重大挑戰。

　　澳大利亞加文醫學研究所的科學家開發了一種新的單細胞測序方法RAGE-Seq（Repertoire and Gene Expression by Sequencing），該方法兼備高通量、靶向、長讀長和單細胞測序特征，能夠高準確度和靈敏度的識別全長抗原受體序列，追蹤與癌癥免疫反應相關的免疫細胞。7月16日，相關研究成果發表于Nature Communications，題為“High-throughput targeted long-read single cell sequencing reveals the clonal and transcriptional landscape of lymphocytes”。

　　癌癥由人體自身細胞發展而來，可以產生有效抗癌免疫反應的免疫細胞通常很少，因此，人體免疫系統往往對癌癥的反應效果不佳。免疫系統中的T淋巴細胞和B淋巴細胞在其表面上表達不同的受體，分別是B細胞受體BCR，T細胞受體TCR。當T細胞或B細胞被抗原刺激分裂并進行克隆擴增時，BCR或TCR序列將作為獨特的“克隆條形碼”，并可提供有關抗原特異性和細胞起源信息。

　　對單個淋巴細胞的BCRs和TCRs與其轉錄組進行并行測序，可以幫助科學家了解免疫系統是如何對癌癥、自體免疫反應等疾病作出反應的。雖然有相關方法可以在單細胞水平上讀取編碼T細胞和B細胞受體的RNA，但現有技術仍不能在單次運行中對腫瘤中的數千個細胞進行分類。

　　加文醫學研究所腫瘤進展實驗室負責人Alex Swarbrk博士指出：“能夠識別癌細胞的免疫細胞通常是罕見的。我們必須對成千上萬的免疫細胞進行分類，找到那些只占腫瘤免疫細胞一小部分的細胞。”將抗原受體序列與單個淋巴細胞的基因表達譜連接起來，有助于進行細胞分類，目前常用的一種方法是單細胞全長RNA測序方法Smart-Seq2。但該方法依賴于平板或良好的微流控技術，因此可以分析的細胞數量有限，通常只有10~100s。長讀長測序技術的最新進展可以彌補短讀長測序的不足，實現完整BCR和TCR轉錄組的測序。但長讀長測序比短讀長測序技術具有更高的錯誤率和更低的測序深度。

　　為解決以上問題，加文醫學研究所的科學家將來自Oxford Nanopore Technologies、10X Genomics、Illumina和CaptureSeq的靶向捕獲富集、長讀長測序、短讀長轉錄組分析和單細胞測序等技術結合，開發出RAGE-Seq方法。

圖：RAGE-Seq概述

　　首先，研究人員開發了一種新的單細胞RNA富集方法，可以靶向富集編碼免疫細胞受體的RNA。同時，他們還開發了一種能夠準確讀取免疫細胞抗原受體完整序列的計算工具。值得注意的是，RAGE-Seq技術可用于高通量的基于液滴的scRNA-Seq工作流程，可準確地將基因表達譜與來自大量細胞的靶向全長mRNA序列進行配對。

　　RAGE-Seq的這種工作方式類似于條形碼追蹤器，通過掃描數千個細胞中的免疫細胞受體，為研究人員提供組織樣本中免疫細胞相互關聯的準確信息，并有助于分析哪種細胞可能對癌癥產生有效反應。此外，該方法不需要流式細胞儀也能進行特定淋巴細胞的分離，因此可用于組織中低豐度淋巴細胞的回顧性表征。

　　為了驗證該方法，研究團隊對來自三陰性乳腺癌患者腫瘤和淋巴結的7,138個細胞樣本進行了RAGE-Seq，以追蹤擴增淋巴細胞克隆的轉錄組譜，識別那些對癌癥產生有效反應的免疫細胞。研究結果顯示，RAGE-Seq能夠有效識別腫瘤和淋巴結組織中的免疫細胞，證明了RAGE-Seq檢測人體組織中體細胞超突變的能力，并發現患者腫瘤的免疫反應具有獨特的遺傳特征和組織特異性富集。

　　RAGE-Seq是一種追蹤大量淋巴細胞克隆進化的有效方法，適用于免疫、自身免疫和癌癥研究。該研究團隊開發的通用實驗工作流程和計算流程，可以將單細胞基因表達與全長mRNA轉錄組的靶向表征相結合。研究結果顯示，RAGE-Seq在Illumina和Nanopore測序平臺上的檢測能力非常強，并且對永生化（immortalized）和原代人B細胞和T細胞全長BCR和TCR序列具有高度敏感性和準確性。與其他免疫分析方法相比，RANG-Seq具有更高的通量和更低的成本。

　　研究人員表示：“RAGE-Seq的一個重要應用是能夠追蹤組織中克隆相關的T或B細胞，對免疫系統進化進行系統性觀察。另一個重要應用就是分析腫瘤中的淋巴細胞及其引流淋巴結，抗原表達的假定部位和腫瘤浸潤淋巴細胞的來源。”在腫瘤組織中識別罕見免疫系統細胞有助于指導個性化治療。此外，更好地了解免疫系統如何對癌癥做出反應，有助于相關抗癌藥物和治療方法的研發。

　　免疫細胞在疾病的發生發展中起關鍵作用。RAGE-Seq的高準確度和單堿基精度特別適用于癌癥體細胞突變的鑒定，為我們提供關于免疫細胞在人體中如何表現的最詳細的視角，在癌癥個性化治療方面有巨大的潛力。此外，RAGE-Seq在多種RNA測序平臺上的適應性和針對一系列基因的靈活性為先進的單細胞分析提供了新的基因組工具包。希望RAGE-seq能夠盡快在臨床試驗中實施，為幫助癌癥患者更快更準確地找到潛在的治療方法提供關鍵信息。

　　雖然目前發表的研究成果主要集中在抗原受體序列上，但研究人員指出，任何目標轉錄組都可以使用改進的RAGE-seq進行定位。據悉，研究團隊正利用RANG-Seq對黑色素瘤患者的樣本進行分析，以獲得這種癌癥對免疫治療反應如此差的新見解。

　　參考資料：

　　1.High-throughput targeted long-read single cell sequencing reveals the clonal and transcriptional landscape of lymphocytes.

　　2.Anticancer Immune Cells Identified Using Antigen Receptor Barcode Tracker.