在RIA中,標記抗原質量的優劣,直接影響測定結果,必須制備比放射性強、純度高的標記抗原,并保持免疫活性不受喪失。
一、同位素的選擇
同位素有穩定性和放射性兩種。放射性同位素可利用其衰變時放出的放射線進行測量,這種測量較靈敏而方便,故多用放射性同位素。標記抗原,常用的放射性同位素有3H、14C、131I和125I等。在使用上各有其優缺點,可根據所進行的放射免疫分析的類型特點,標記物制備和供應情況以及實驗室設備條件等作適當的選擇(表8-1)。大多數抗原分子中都含有C、H等原子,所以用14C或3H標記不改變抗原的結構及其免疫學活性,且14C、3H半衰期長,所標記的抗原長時間放置后仍可使用,這都是其優點。14C或3H標記的不足之處是操作較繁瑣,并難以獲得高比放射性的標記物;3H及14C放出的都是弱β射線,需用較昂貴的液體閃爍計數器方能獲得較高效率的測量,且測定操作也較麻煩。但某些抗原用放射性碘標記容易喪失免疫化學或生物學活性者,則仍以采用3H或14C標記物為佳。
表8-1 標記抗原常用的放射性同位素及其性質
放射性元素 | 半衰期 | 射線種類及能量(百萬電子伏特) | |
β | γ | ||
14C | 5720年 | 0.155 | - |
3H | 12.5年 | 0.0189 | - |
125I | 60天 | - | 0.035 |
131I | 8.05天 | 0.608,0.335,0.250 | 0.364,0.637,0.722 |
大多數抗原分子中是不含碘的,引入碘原子就改變了抗原的分子結構,往往容易損傷抗原的免疫化學活性;且放射性碘的半衰期較短,標記物放置后因衰變使放射性降低,因而需要經常制備標記物或要求能定期提供放射性碘標記都能適用,放射性碘放出γ—射線,用一般晶體閃爍計數器就能獲得較高效率而精確的測量,測量操作也很簡單。由于這些突出的優點,目前在放射免疫分析中,使用放射性碘標記物最多。
從應用角度來看,131I和125I又各有其優缺點,可根據實驗的要求、儀器的條件和放射性碘制劑的規格等條件合理選用。但相對而言,125I有較多的優點,一是半衰期適中,允許標記化合物的商品化及貯存應用一段時間;二是它只發射28keV能量的X射線和35keV能量的γ射線,而無β粒子,因而輻射自分解少,標記化合物有足夠的穩定性。放射性碘適用于放射免疫分析許多對象(包括蛋白質、肽類、固醇類、核酸類以及環型核苷酸衍生物等)的標記,且操作簡單,一般實驗室都不難做到。
二、蛋白質與多肽激素的放射性碘標記
要制備高比度、高純度與免疫化學活性好的標記物,首先要有高純度、良好免疫活性的抗原。用作放射標記加網免疫分析的特異性,所以若用純度不高的抗原作標記,則標記后必須采取適當的步驟除去雜質,以獲得高純度的標記物。標記對象的純化應盡量采用溫和的方法,否則在純化操作中已受潛在性損傷的蛋白質(這時表面上活性可能還是良好的),再經標記反應時所受的損傷,活性就會顯著降低,影響以后的放射分析結果。有了好的純抗原,還要采用適當方法加以標記,盡量獲取高比放射性、而又能保持良好的特異免疫化學活性的標記物。這些都是放射免疫分析能取得高特異性和高靈敏度的關鍵問題。
多肽激素與蛋白質多用碘標記,最常用的是125I。碘化反應的基本過程如下:通過氧化劑的作用,使碘化物(125I-)氧化成的碘分子(125I2),再與多肽激素、蛋白質分子中的酪氨酸殘基發生碘化作用。所以不管采用哪一種放射性碘標記法,標記的化合物內部必須有碘原子可結合的基團,即結構上要含有酪胺基或組織胺殘基。凡蛋白質、肽類等抗原,在結構上含有上述基團的可直接用放射性碘進行標記。如不含上述基團的,放射性碘無法標記,必須在這些化合物的結構上連接上述基團后才能進行碘標記。
因此影響蛋白質、多肽碘化效率的因素,主要決定于蛋白質、多肽分子中酪氨酸殘基的數量及它們在分子結構中暴露的程度;此外,碘化物的用量、反應條件(pH、溫度、反應時間等)及所用氧化劑的性質等也有影響。
常用的標記方法有:
(一)氯胺T法
氯胺T法標記效率高、重復性好、試劑便宜易得,是目前使用最多的碘標記方法。
1.原理氯氨—T(Chloramine--T)是一種溫和的氧化劑,在水溶液中產生次氯酸,可使碘陰離子氧化成碘分子。這活性碘可取代肽鏈上酪氨酸苯環上羥基位的一個或兩個氫,使之成為含有放射性碘化酪氨酸的多肽鏈。
2.方法以125I—AVP的制備為例。
(1)碘化反應:AVP5μg+0.5mol/l PB50μl(pH7.5)+1251800μCi,混合后,加入新配置的Ch—t 30μg/15μl(0.05mol/l PB, pH7.5)。迅速振蕩混勻,室溫下反應40s。
(2)終止碘化反應:加入還原劑偏重亞硫酸鈉40μg/20μl(0.05mol/l PB, pH7.5),以終止碘化反應。
(3)Bio—Gel P2層析純化:將碘化反應混合液注入Bio—Gel P2柱,用0.1n HAC溶液洗脫,分部收集,每2min收集一管,共收集60管。
(4)放射性測量:測定各收集管的放射性,出現兩個峰,第一峰為125I—AVP,第二峰為游離碘鹽峰。第一個峰中計算最高的幾管,留下備用。
為了解標記抗原的質量,每次碘標記后應計算出碘的利用率,標記上多少放射性碘,以及每微克抗原結合上多少放射性碘。
(5)標記抗原的貯存:經純化與檢查后的標記物、加入1/8體積的異丙醇,分成若干小份,置于鉛罐中,在-20℃以下的冰箱中貯存備用,應避免反復凍融。標記抗原在貯存中是不穩定的,這是因為:一是脫碘,標記的碘從原來位置上脫落,變成游離碘;二是蛋白損傷、變性,成為聚合大分子或斷鍵成小分子碎片。由于上述原因,使B/F明顯降低,標準曲線斜率變小,以致不能使用,故需分離純化,其方法是用Sephadex G100長柱(40~80cm )過柱,洗脫后出現3個峰。第1個峰分子量大,是蛋白變性的聚合的大分子,尚保留部分抗原決定簇,免疫活性弱;第2個峰是純抗原的蛋白峰,免疫活性好;第3個峰是游離125I或小分子碎片,不具備免疫活性。收集到的第2個純抗原蛋白峰,免疫活性好;第3個峰是游離125I或小分子碎片,不具備免疫活性。收集到的第2個純抗原蛋白峰,其性能類似于新鮮標記的抗原。分離純化的方法解決了標記抗原的貯存、長期使用問題,特別對來之不易的抗原更顯得重要。
2.注意事項
(1)放射性碘源的選用:無載體的131I或125I均可用于碘化標記,但應盡量選用新鮮的、比放射強度高的、含還原劑量少的放射性碘源。碘源的比放射強度最好≥50~100mCi/ml,至少也要>30mCi/ml,否則加入碘源的容量要增加,隨著帶入碘源中含有的還原劑(為放射性碘源運輸保存所需加入)量也增加,這將會顯著降低碘利用率及標記蛋白比放射強度。放置較久和放射性碘源,一方面因衰變致比放射強度降低,另一方面因水的輻射化學產物增多(主要是131I源),都會降低標記時的碘利用率。放射性碘源含還原劑(如Na2S2O5等)量多時,會抵消氯胺T的作用,降低碘利用率,甚至導致標記完全失敗。放射性碘源要用無載體的,標記所用全部用具和試劑必須不含碘;只要有極少量的碘的污染,非放射性碘就會稀釋放射性碘,使放射性碘利用率顯著降低。為了便于放射性防護和除污染,以及減少射線對蛋白質分子的損傷,標記投入的放射碘量不宜過大,一般以<5mCi為宜。
(2)放射性碘與多肽、蛋白質用量的比例:這比例對標記結果的影響很大。如上述原因,一般標記時放射性投入量不宜過多,示蹤實驗室中常規每次只用1~2mCi,因而放射性碘與多肽、蛋白質用量的比值主要靠標記時投入的多肽、蛋白質用量來控制。當投入的放射碘量一定時,多肽、蛋白質用量多(即I/多肽、蛋白質比值低),能獲得高碘利用率,但所得標記蛋白比放射強度低;相反多肽、蛋白質用量少(即I/多肽、蛋白質比值高),則碘利用率降低,但所得標記多肽、蛋白比放射性隨此比值變化都有較大的變動;而當此比值<1后,則碘利用率再下降的幅率較小,標記多肽、蛋白比放射性也不會再增加多少。
(3)氯胺T與偏重亞硫酸鈉的用量及碘化反應時間:氧化碘化標記法中,會導致失活的最主要原因是氧化還原。氯胺T是氧化劑,早期用氯胺T法作碘化標記時氯胺T用量都比較大,或碘化反應時間較長,結果導致蛋白質結構和活性的嚴重損傷。氯胺T用量大,或長時間進行碘化反應,結果并不能使碘利用率和標記多肽、蛋白質比放射強度提高多少,反而使標記多肽、蛋白活性下降。當用不含還原劑或還原劑很少的放射性碘源時,試以各種蛋白質(包括白蛋白、球蛋白、ACTH、胰島素等)作微量標記,當氯胺T用量為20μg/0.1ml反應液、0~20。C反應20s,碘利用率都已接近或達到最大峰,再加大氯胺T用量和延長反應時間是沒有必要的。隨放射性碘源中還原劑增多,氯胺T用量也應增加,以達到預期的碘利用率,但決不應盲目加大氯胺T用量和延長碘化反應時間(通常反應時間不要超過1min),否則會導致標記多肽、蛋白質嚴重失活,不能用于實驗。當然,減少氯胺T用量要在了解放射性碘源還原劑含量的基礎上,否則碘源中還原劑量較多,雙盲目減少氯胺T用量,就會使標記失敗。一般用125I標記時,氯胺T用量要適當加大。加入氯胺T后必須迅速混勻,以防標記不均勻。氯胺T與偏重亞硫酸鈉溶液要新配制的。
氯胺T用量減少了,Na2S2O5用量也就可以隨之減少。為保證按時終止碘化反應,實驗時加入Na2S2O5一般都是過量的。氯胺T用量大時,加入Na2S2O5的剩余量也就會隨之增加,這就可能加重某些對還原劑敏感的蛋白質或多肽生物活性的損傷。為此,Na2S2O5用量也不應過多。只要藥品沒有變質、試劑是新配的,以重量計算Na2S2O5加入量與氯胺T相同就足以保證終止碘化反應(按反應克分子濃度計算,Na2S2O5/氯胺T重量比約0.4),不要盲目加大用量,并應迅速將標記多肽、蛋白質從反應液中分離出來,以盡量減少多肽、蛋白質活性的損傷。
某些蛋白質或多肽對氯胺T較敏感,還可進一步減少氯胺T用量、縮短碘化反應時間、降低反應溫度,以保護蛋白質的活性。這對一些較容易喪失活性蛋白質或多肽的碘標記十分重要。
(4)碘化反應體積:系指加入Na2S2O5終止反應前液體的總量。碘化反應體積愈小,局部反應物濃度愈高,所得碘利用率和標記多肽、蛋白比放射強度就愈高。所以,標記應采用比放射標記效果。當反應液量少(<0.2~0.3ml)時,反應體積對碘利用率和標記多肽、蛋白質比放射強度的高低影響較大;當反應液量大(>0.5~1.0ml)時則影響較小。微量氯胺T法放射碘標記時,一般多控制碘化反應體積<100μl。
(5)碘化反應溫度:溫度升高,碘化反應速度加快,碘利用率有所增加。但總的來看,反應溫度的影響不很大,一般從0℃到20℃碘利用率相差不過百分之幾,故一般在室溫下進行標記操作就可能獲得重復性好的結果。有些蛋白質或肽類極易喪失活性,則可在0℃進行碘化反應。
(6)碘化反應的pH值:受氧化劑氧化生成的活性碘,對多肽鏈的酪氨酸基苯環羥基鄰位的碘化作用,最適pH是7.3~7.8之間。當pH變化時,碘化位置也會發生變化,例如pH值較高時,組氧酸的咪唑環也可被碘化;當pH4~5時,活性碘能迅速氧化色氨酸基生成羥基吲哚,導致肽鏈斷裂。這些都會影響蛋白質或多肽的放射性碘化反應,或引起降解或失活。因此作放射性碘化標記時,除放射性碘源外,所有的試劑都應用適當的緩沖液配制,保證碘化反應在最佳pH條件下進行。
(7)微量蛋白質或多肽的吸附損失:界面的吸附損失,在使用大量蛋白質或多肽類時是可以忽略的,但作微量法標記時投入的蛋白質或多肽類只在微克甚至毫克甚至毫微克水平,界面吸附導致的損失就不能忽略。例如制備131I—ACTH時,所用ACTH濃度低到50Pg/ml時,因表面吸附可損失10%~30%,甚至高達75%。改變pH、加入非特異性載體蛋白、或使用聚苯乙烯、聚乙烯容器時,能減少吸附,但不能完全消除。一般殘留在反應管和滴管上的放射性為投入總放射性的2%~8%、殘留在層析柱上折占5%~10%。殘留量隨標記蛋白比放射性強度而直線增減,殘留者幾乎全部都是標記蛋白。由此可見,微量蛋白質或多肽受吸附而損失的量是不容忽略的。由于微量蛋白質、多肽會被顯著吸附而丟失,所以標記時投入蛋白質、多肽量過微(如<2μg)也是不適宜的,否則標記蛋白質、多肽的收回率會太低,并在計算上會造成較大的誤差。
(8)不同蛋白質、多肽碘化標記的差別:由于不同的蛋白質和多肽分子中含有的酪氨酸數目不同,而且其空間結構也不相同,分子中的酪按酸殘基有的容易發生碘化反應,有的就不容易碘化,因此同樣條件下進行碘化標記,不同蛋白質或多肽對碘的利用率是不相同的。不同蛋白質經碘化標記后生物活性受損的情況也各不相同。例如ACTH、促性腺激素釋放激素(GRH)、促黃體激素釋放激素(LRH)等多肽,碘化標記后容易喪失激素活性或與受體結合的活性;而AFP及人絨毛膜促性腺激素(HCG)等的碘化標記,則較容易保存良好的免疫化學活性。
盡管不同多肽、蛋白度的碘化標記結果有所差別,但上述討論的因素對不同多肽、蛋白質碘化標記的影響有共同的規律。掌握了這些因素,就容易成功地獲得合格的標記物。
不同多肽、蛋白質的分子量大小、理化性質各不相同,放射碘化標記反應后,可根據具體情況采取不同的方法將標記蛋白質(或多肽)與未反應的游離放射性碘及受損傷的標記物分開,常用的方法有凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析、各種電泳法等。
(二)乳過氧化物酶法(LPO)
本法反應溫和,對抗原、抗體免疫活性影響小,已被廣泛應用。缺點是標記率較低,一般為20~40%。
1.原理此法是利用乳過氧化物酶(Lactoperoxidase)有促進微量過氧化氫對125I-的氧化作用,生成125I+,并標記在多肽、蛋白質酪氨酸分子上。
2.方法以標記蛋白質抗原為例。
(1)反應液組成:蛋白質2~5μg溶于磷酸緩沖液10~25μl中,加入Na125i 1m Ci(10μl)、乳過氧化物酶溶液25ng(10μl)、H2O2200ng(10μl);
(2)在室溫保溫7min;
(3)加入H2O2200ng(10μl);
(4)過7min再加入H2O2(3μl);
(5)保溫7min后,加入0.5ml、10mmol/L巰基乙醇以停止反應;