GFP在大腸桿菌中的誘導表達及超聲破碎抽提

實驗概要

本實驗介紹了GFP在大腸桿菌中的誘導表達和細菌蛋白的超聲破碎抽提原理及操作步驟等。

實驗原理

把含有外源基因的表達載體轉化的大腸桿菌在有相應抗菌素和誘導物的條件下培養，可以誘導外源蛋白在大腸桿菌中表達。利用溶菌酶、反復凍融或超聲波破碎的方法將誘導培養的細菌的細胞壁破碎后，可使那些可溶性的外源蛋白釋放出來，再利用硫酸銨沉淀、蛋白質層析技術和制備電泳等方法能夠將外源蛋白分離純化出來，供進一步的研究使用。有些過量表達的外源蛋白往往在細菌中形成不溶性的包涵體，細胞破碎、離心后這些包涵體出現在沉淀中，這樣的蛋白需要用高濃度的尿素或   SDS變性處理后才能溶解。超聲破碎時要產生大量的熱，會引起蛋白的變性。為了避免產生高溫，超聲時一般使用間隔的脈沖處理，而且應在冰浴中進行。本實驗使用超聲波破碎法抽提蛋白，因為表達的外源蛋白GFP（綠色熒光蛋白）比較耐高溫，故省去了冰浴。

主要試劑

1. LB培養液
2. 氨卞青霉素
3. L-阿拉伯糖
4. 硫酸銨
5. 細菌蛋白抽提液（100mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA， pH 8.0)

主要設備

1. 恒溫搖床
2. 小型高速離心機
3. 超聲波組織細胞破碎儀
4. 玻璃試管，三角瓶
5. 1.5mL和5mL 塑料離心管
6. 移液槍，槍頭

實驗材料

pGLO轉化的大腸桿菌

實驗步驟

1. 大腸桿菌的誘導培養：
   1) 從Amp /LB瓊脂板上培養的pGLO轉化的大腸桿菌中挑取2-3個菌落，接種于 Amp （終濃度為50微克/mL）的5mL LB的玻璃試管中，培養兩管，放恒溫搖床中，37℃培養過夜。

   2) 將其中一管保存于4℃，另一管所有5mL的培養物加到裝有150mL的LB培養液的三角瓶中，加入L-阿拉伯糖干粉150毫克和氨卞青霉素（終濃度為50微克/mL），恒溫搖床上37℃振蕩培養過夜。
2. 超聲破碎抽提：
   1) 將誘導培養的大腸桿菌培養物轉移到數只5mL離心管中，8000轉/分離心5分鐘，傾去上清液后，在沉淀上面再加培養物，繼續離心，將所有的培養物都收集在一起。

   2) 每管中加入1.5mL的細菌蛋白抽提液（100mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA， pH 8.0），用槍吹打，使沉淀懸浮。

   3) 將離心管放在小試管架上，將超聲波破碎儀的金屬頭插到離心管中，調整好試管的位置后關上超聲破碎儀的門，打開儀器的電源，對每只離心管中的菌體進行超聲破碎。條件：功率80瓦，工作2秒，間隔2秒，每一次處理5個循環。
   4) 4次處理后，8000轉/分離心5分鐘。

   5) 取出離心管，在紫光燈下觀察離心管底的沉淀，如果大量沉淀仍然為綠色，則說明破碎不夠，繼續按前面方法再超聲處理2次，然后再離心。如果僅有很少的綠色沉淀或根本看不到，說明破碎完全。
   6) 小心吸出上清液，集中放到干凈的5mL離心管中，體積不要超過4mL，逐步地加入少量硫酸銨干粉，使達到飽和，8000轉/分離心5分鐘。

  7) 將離心管取出，放紫光燈下觀察，沉淀中應該能看到明亮的綠色熒光。將上清液傾去，蛋白沉淀物4℃保存，或冷凍于-20℃。