實驗概要
運用原子力顯微鏡(AFM)表征3種DNA純化試劑盒對DNA的純化效果。方法：PCR擴增K562/A02細胞mdr1基因DNA，分別以3種不同的DNA純化試劑盒對PCR產物進行純化后，按終濃度為10 ng?μl-1固定在用1 ng?μl-1 L型多聚賴氨酸預先處理過的新剝離的云母片上，用AFM獲取DNA掃描圖像，分析評價3種DNA試劑盒對DNA的純化效果。
實驗原理
原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）是具有原子級分辨率的新一代顯微鏡，因其能夠對DNA、蛋白質、磷脂生物膜、多糖等生物大分子以及有機化合物的形態及功能進行觀察研究而引起了人們的廣泛關注。近十幾年，運用AFM在固相載體表面研究DNA分子技術取得的巨大進步，大大地增進了人們在分子層面上對DNA分子的了解。AFM在樣本制備上相對較容易，但用于DNA研究時，要想得到質量較高的DNA圖像對DNA樣品的純度要求較高。我們選擇了3種不同的DNA純化試劑盒對K562/A02細胞株mdr1基因769bp DNA的PCR產物進行純化后在相同條件下用AFM觀測，通過比較，建議其中的兩種可用于AFM的DNA樣品的純化。
主要試劑
1. 含10%小牛血清的RPMI 1640(Gibco/BRL公司產品)培養液
2. 酚/氯仿
3. 1ng?μl-1 L型多聚賴氨酸(Sigma公司產品)
4. 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP2092，TIANWEI公司產品）
5. DNA小量膠回收試劑盒（W5211，2408A，Waston公司產品）
6. 瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒（DV805A，TaKaRa公司產品）
主要設備
1. 37℃、5%CO2培養箱
2. 低溫冰箱
3. 紫外分光光度計
4. PCR儀
5. 紫外特攝儀
6. 電泳系統
7. Nanoscope AFM (Veeco/Digital Instruments，Santa Barbara，CA)
實驗步驟
1. 細胞培養
K562/A02細胞株接種于含10%小牛血清的RPMI 1640(Gibco/BRL公司產品)培養液，置于37℃、5%CO2培養箱中常規培養，2~3d傳代1次，實驗前無藥培養兩周。
2. DNA提取
取對數生長期、終濃度2×105ml-1的K562/A02細胞3ml，以酚/氯仿法抽DNA后，加100μl TE緩沖液于-20℃保存。用紫外分光光度計定量，要求A260/A280≥1.8。
3. PCR擴增
從基因庫中查得所需mdr1的基因序列號，引物根據基因庫提供的基因全序列用計算機軟件Primer3設計，引物序列：上游5′ATACTTTACTCCTTCCTTCAA3′，下游5′TCTGAATAAAGTAGATTTCTTCATG3′，擴增K562/A02 細胞mdr1基因-758～＋11的DNA，片段長度為769bp。PCR反應體系：純化的DNA模板2.5μ1，50pmol?L-1上下游引物各1μ1，25mmol?L-1 MgCl2 1.5μ1，dNTP4μ1，5×PrimeStaRTM緩沖液(含Mg2＋)10μ1，10mmol?L-1 PrimeStaR HS DNA聚合酶0.5U，余用滅菌去離子水補至50μ1。熱循環參數為： 98℃變性10s，55℃退火10s，72℃延伸1min；擴增30個循環。
4. 10g?L-1瓊脂糖凝膠電泳
取10μl PCR產物，加2μl溴酚藍上樣緩沖液，加入3個點樣孔行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在TAE電泳緩沖液中，電壓5V?cm-1，45min后取出凝膠置于紫外透射儀上顯影拍照。
5. DNA純化
在紫外特攝儀下切取3條含有清晰目的ＤＮＡ條帶的凝膠塊，分別用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP2092，TIANWEI公司產品）、DNA小量膠回收試劑盒（W5211，2408A，Waston公司產品）及瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒（DV805A，TaKaRa公司產品）按相關說明書進行純化，純化樣品于-20℃保存。
6. 樣本的制備
用1ng?μl-1 L型多聚賴氨酸(Sigma公司產品)預先處理新剝離的云母片(25px×25px)。多聚賴氨酸處理過的云母片用雙面膠帶粘附于甩膜機上，分別滴加以3種DNA純化試劑盒純化后，終濃度為10ng?μl-1的K562/A02 細胞mdr1 DNA樣品20μl于云母片中央，并在室溫下作用2min，用7000r?min-1離心，用吸量管吸1000μl去離子水滴加在旋轉的云母片中央，沖洗3遍，時間持續1min，制備成3份DNA觀測樣品。
7. AFM觀察和分析
樣品使用Nanoscope AFM (Veeco/Digital Instruments，Santa Barbara，CA)觀測，在tapping模式下操作，像素密度為512×512，操作條件是室溫、空氣中，相對濕度不超過37%。用125μm 硅針尖tapping模式下共振頻率為300~400kHz、針尖掃描頻率為 1~2Hz進行掃描。獲取掃描圖像后，用Veeco/Digital Instruments公司的程序軟件將圖像進行去噪聲處理，獲得清晰的DNA圖像。通過圖像分析，評價3種試劑盒對DNA的純化效果。