繪制細胞增殖曲線

實驗概要

為了掌握細胞的增殖速率，常用的方法有不同時間點細胞數目統計、MTT法繪制增殖曲線等。下面以MTT法為例，簡述繪制增殖曲線的方法。

實驗原理

活細胞線粒體中的脫氫酶能夠還原黃色的MTT為藍紫色的不溶于水的甲瓉（formazan）,甲瓉的多少可通過酶標儀測定其在490nm處的光密度（Optical Density，OD）值而得知。因為甲瓉生成量在通常情況下與活細胞數成正比，因此可以通過OD值推測活細胞數目，了解藥物抑制或殺傷細胞的能力。

主要試劑

DPBS、5mg/mLMTT
待檢測的藥物根據實驗要求設置濃度梯度

主要設備

96孔平底板、酶聯免疫監測儀

實驗步驟

（1）收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，在96孔平底板每孔加入100μL細胞懸液，鋪板使待測細胞調密度至每孔約1000～10000個細胞，邊緣孔用無菌DPBS填充。
（2）5%CO₂、37℃培養箱孵育約12 h，至細胞單層鋪滿孔底，加入濃度梯度的藥物。
（3）5%CO₂、37℃孵育16～48 h，于倒置顯微鏡下觀察細胞密度和細胞形態。
（4）每孔加入20μL5mg/mL MTT溶液，繼續培養4～8h。
注意：若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養液，小心用DPBS沖2～3遍后，再加入含MTT的培養液。
（5）終止培養，小心吸去孔內培養液。
（6）每孔加入150μL DMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。通過酶聯免疫檢測儀，測量490nm處的吸光值。
（7）用不同的生長時間和吸光值作圖，橫軸為時間點，縱軸為吸光值。
注意：

1. MTT法只能測定細胞的相對數和相對活力，不能測定細胞的絕對數。
   

2. 用MTT檢測時，盡量無菌操作，細菌會對MTT結果產生影響。
   

3. MTT實驗結果波動較大，應多設置重復孔，并且做好預實驗，優化實驗條件，盡可能減小實驗結果差異。
   

4. 接種細胞的細胞數和細胞懸液的均勻程度對MTT結果有很大影響。盡量使細胞處于對數期的時候進行檢測，并且，初始接種的細胞懸液一定要均勻。