細菌標本經染色后,由于細菌與周圍環境間在顏色上形成鮮明對比,故在普通光學顯微鏡下可清楚地觀察到細菌的形態特征(如細菌的大小、形狀、排列等)和某些特殊結構(如莢膜、鞭毛、芽孢等),并可根據染色反應性對細菌加以分類鑒定。
(一)細菌染色的一般程序
細菌染色的一般程序是:涂片(干燥)—固定—染色(媒染)—(脫色)—(復染)。
1.涂片制備
血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液體培養物,直接在載玻片上作薄膜涂片;尸檢或感染動物組織,病變局部涂抹采樣的棉拭子直接涂片。固體培養基上的菌落或菌苔的制片,先用接種環取一環生理鹽水置載玻片中央,再用無菌接種環取少量的培養物在生理鹽水中磨勻,涂布成1cm2大小的涂面,置室溫下自然干燥或遠火慢慢烘干。
2.固定
目的是殺死細菌,凝固細菌蛋白及結構,便于染色;促使細菌粘附在載玻片上,避免在水洗過程中被水沖掉;改變細菌對染料的通透性,有利于菌細胞內結構的染色。通常用火焰加熱固定,將已干燥的涂片在火焰中迅速通過3次,以手背皮膚接觸玻片不燙為佳。
3.染色
根據檢驗目的不同,選擇不同的染色方法進行染色。染色時滴加染液,以復蓋標本為度。
4.媒染
凡能增強染料和被染物的親和力,使染料固定于被染物及能引起細胞膜通透性改變的物質,稱媒染劑。常用的有明礬、鞣酸、金屬鹽和碘等,也有用加熱法促進著色。媒染劑可用于初染與復染之間,也可用于固定之后或含于固定液、染色中。
5.脫色
凡能使已著色的被染物脫去顏色的化學試劑稱為脫色劑。常用乙醇、丙酮等作為脫色劑。脫色劑可以查出細菌與染料結合的穩定程度,作為鑒別染色之用。
6.復染
已脫色處理的細菌或其結構常以復染液作復染以便于觀察。復染液與初染液的顏色不同而成一鮮明對比。復染不宜太強,以免掩蓋初染的顏色。