液相色譜串聯質譜法

尿樣

睪酮表睪酮雄酮苯膽烷醇酮DHEA內標甲基睪酮標準品甲醇甲酸乙酸銨磷酸緩沖液β-葡萄糖醛酸甙酶乙醚

三重四極桿串聯質譜儀液相色譜系統恒溫水浴鍋

1.樣品收集

健康志愿者6名，其中男性3名，女性3名。志愿者受試前留取空白尿液； 口服120 mg DHEA片劑后,再收集0～24 h的尿液，于-20℃下保存。

2.樣品處理

取尿液210 mL于試管中，加入5 ng甲基睪酮(內標)及210 mL pH6.8的磷酸緩沖液、150 μL β-葡萄糖醛酸甙酶(3 000 U)，于80℃恒溫水浴中培養3 h，取出后冷卻至室溫。再加入3.5 mL乙醚，混旋，離心，取出有機相并于60℃水浴中揮干，殘渣中加入100 μL 流動相溶解，供LC-MS/MS分析。

3.色譜及質譜條件

液相色譜：采用Cosmosil C18色譜柱(150 mm×2 mm，5μm )和Phenom enex C18預保護柱。流動相為甲醇-0.1%甲酸緩沖液(含0.02 mol/L乙酸銨) (體積比為68∶32) , 流速為200 μL/min。進樣量為5 μL。

串聯質譜：采用電噴霧電離源( ES I) ，在多反應監測(MRM )正離子模式下掃描。碰撞氣(CAD )壓力為48 263 Pa；氣簾氣(CUR)壓力為68 948 Pa；霧化氣(GS1)壓力為241 317 Pa；輔助加熱氣(GS2)壓力為275 790 Pa。噴霧電壓為5 500 V；離子化溫度( TEM )為500 ℃。

選取各目標物的兩組特征母離子 /子離子對 ,分別優選其最佳碰撞電壓 (CE)和去簇電壓 (D P ) 。并采用豐度較強的一組母離子 /子離子對進行定量分析。

1. 液相色譜分離條件的優化是本研究的關鍵。睪酮與表睪酮、雄酮與苯膽烷醇酮均為同分異構體 ,具有相同的母離子和子離子 ,必須依靠色譜方法進行分離。

2. 每個目標物選取低、中、高 3種濃度的樣品 ,以3種濃度樣品與對應標準溶液測定結果相比求得回收率 ,并考察方法的精密度、準確度。

來源：《液相色譜-串聯質譜法測定尿液中的內源性類固醇激素》