1. 涂片將培養14~16小時的枯草芽孢桿菌和培養24小時的大腸桿菌分別作涂片（注意涂片切不可過于濃厚），干燥、固定。固定時通過火焰1~2次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。
2. 染色
（1）初染加草酸銨結晶紫一滴，約一分鐘，水洗。
（2）媒染滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約一分鐘，水洗。
（3）脫色將載玻片上面的水甩凈，并襯以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現紫色時為止，約20~30秒鐘，立即用水沖凈酒精。
（4）復染用番紅液染1~2分鐘，水洗。
（5）鏡檢干燥后，置油鏡觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。以分散開的細菌的革蘭氏染色反應為準，過于密集的細菌，常常呈假陽性。
（6）同法在一載玻片上以大腸桿菌與枯草芽孢桿菌混合制片，作革蘭氏染色對比。
革蘭氏染色的關鍵在于嚴格掌握酒精脫色程度，如脫色過度，則陽性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時，陰性菌可被誤染為陽性菌。此外，菌齡也影響染色結果，如陽性菌培養時間過長，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應。
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