1. 取一清潔載玻片，傾注3.5~4.0毫升加熱熔化的1%食鹽瓊脂制成瓊脂板。
2. 凝固后，用直徑3毫米打孔器，孔間距為5毫米。孔的排列方式如圖2所示。
圖2 雙向瓊脂擴散原抗體孔位置示意圖 3. 用微量進樣器于中央孔加抗體，于周圍孔加各種抗原。加樣時勿使樣品外溢或在邊緣殘存小氣泡，以免影響擴散結果。
4. 加樣后的瓊脂板收入濕盒內置37℃溫箱中擴散24~48小時。
5. 結果觀察：若凝膠中抗原抗體是特異性的，則形成抗原—抗體復合物，在兩孔之間出現一清晰致密白色的沉淀線，為陽性反應。若在72小時仍未出現沉淀線則為陰性反應。實驗時至少要做一陽性對照。出現陽性對照與被檢樣品的沉淀線發生融合，才能確定待檢樣品為真正陽性。
6. 結果分析：瓊脂擴散結果受許多因素影響。
（1）抗原特異性與沉淀線形狀的關系：在相鄰兩完全相同的抗原與抗體反應時，則可出現兩單沉淀線的融合。反之，如相鄰抗原完全不同時，則出現沉淀線之交叉；兩種抗原部分相同時，則出現沉淀線的部分融合。見圖3。
圖3 雙擴散試驗結果示意圖 A：已知抗體 a、b：陽性對照 c、d、e、f：被檢材料 （2）抗原濃度與沉淀先導形狀的關系：兩相鄰抗原濃度相同，形成對稱相融合的沉淀線；如果兩抗原濃度不同，則沉淀線不對稱，移向低濃度的一邊。見圖4。 
圖4 抗原特異性與沉淀線形狀的關系 a、b：抗體 A、A’、B：抗原 A、B完全不同 A、A’部分相同 （3）溫度對沉淀線的影響：在一定范圍內，溫度擴散快。通常反應在0~37℃下進行。在雙向擴散時，為了減少沉淀線變形并保持其清晰度，可在37℃下形成沉淀線，然后置于室溫或冰箱（4℃）中為佳。
（4）瓊脂濃度對沉淀線形成速度的影響：一般來說，瓊脂濃度越大，沉淀線出現越慢。
（5）參加擴散的抗原與抗體間的距離對沉淀線形成的影響：抗原、抗體相距越遠，沉淀線形成的越慢，所以在微量玻片法時，孔間距離以0.25~0.5 cm 為好，距離遠影響反應速度。當然孔距過遠，沉淀線的密度過大，容易發生融合，有礙對沉淀線數目的確定。
（6）時間對沉淀線的影響：沉淀線形成一般在1-3天出現，14-21天出現的數目最多。玻片法可在1~2小時出現，一般觀察72小時，放量過久可出現沉淀線重合消失。
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