釀酒酵母培養條件實驗——液體培養基中細胞滴度的檢測

酵母在瓊脂或液體培養基中的理想培養溫度是30℃，培養皿平板應倒置放入塑料盒中，于孵箱或培養室內進行培養。當孵育時間超過2或3天時，塑料盒可防止平板上的瓊脂干裂。當使用液體培養基培養時，要使用旋轉式或往復式搖床，至少每分鐘200轉，以保證充分通氣；進行大體積液體培養時使用錐形瓶，培養基為瓶容積的1/5到1/3。雖然帶三重擋板的搖瓶比較昂貴，但每瓶有較多培養基時細胞生長良好。5~10ml的小量培養，可以使用玻璃試管或塑料試管，放入固定于揺床平臺上的傾斜支架內，這樣可獲得最好的通氣? 用滅菌的15mm x 100mm的一次性塑料管進行培養，培養基的量最多為2ml; 而用20mm x 150mm帶塑料蓋的玻璃管進行培養，培養基的量最大可到10ml。

可用接種環或滅菌的牙簽接種平板或液體培養基，一般使用直徑為2~3mm的鉑或鎳接種環。滅菌扁平牙簽的大頭也可用于酵母細胞的劃線接種，以獲得單菌落。牙簽還可用于重復操作，如多次接種或在方格網上的菌落點斑接種以便進一步的研究等。牙簽應寬頭朝下放人玻璃樣品瓶（24mmx 62mm)，用 Morton培養管罩子(直徑25mm) 蓋上，高壓滅菌。

YPAD 過夜培養物釀酒酵母

YPAD 或 SC 減樣選擇培養基甘油

平板分光光度計天鵝絨

在復合培養基如YPAD中，當接種足量的細胞并于30℃培養過夜（16小時），使其分裂10代，大多數酵母菌株滴度可達2 x 108到3 x 108個細胞/ml; 而在合成培養基如SC減樣選擇培養基中，細胞滴度為1 x 107到2 x 107個細胞/ml。可以用幾種方法來檢測培養物的滴度，如測定600nm處的光密度（OD600)，或用血細胞計數器和顯微鏡進行細胞計數。對大多數菌株來說， OD600為0.1相當于細胞滴度為1x106個細胞/ml。用血細胞計數器檢測細胞密度比較費時間，但可以直接觀察酵母細胞，這樣可以識別健康與污染的培養物。

一、分光光度測定法

1. YPAD 過夜培養物用水 100 倍稀釋，而 SC 減樣選擇培養基過夜培養物 10 倍稀釋。

2. 用分光光度計測定 600 nm 處的光密度。

3. 記住稀釋倍數，計算原始培養物的細胞數。

二、血細胞計數器計數法

在任何種類固體培養基上的酵母菌落可以被影印培養到其他種類的培養基中，以便進行特定表型的篩選或鑒定。有代表性的做法是用一個自制的復制器具進行，它由一個直徑77mm的木頭或金屬圓柱體和一個配上去稍大的內徑80mm的金屬環構成。將一塊15cmx15cm見方的棉制天鶴滅在圓柱體上展平，并用金屬環固定，以作為復制介質。一平方米天鶴絨可制成大約36塊，洗滌后置于平面上于室溫干燥，用棉絮輥去掉棉絮，絨面向下放入滅菌盤或其他合適的容器中，高壓滅菌。

1. YPAD 過夜培養物用水 100 倍稀釋，SC 減樣選擇培養基過夜培養物不進行稀釋而直接計數。

2. 將細胞懸液小心地加在蓋片和血細胞計數器之間。

3. 計數 5 個對角方格中的細胞數量，乘以 5 即是整個網格區細胞的總數。

4. 計算細胞滴度：計數的細胞數 X 5 X 稀釋倍數 X 1/血細胞計數器 25 個方格的容積。

1. 對于處于對數生長期的培養物不必進行稀釋。

2. 釀酒酵母是以母細胞發芽的方式進行分裂，因此將發芽的細胞計數為一個單細胞。只有當細胞上形成明顯的另外的芽時，才能按相同芽大小計數為兩個細胞。一些菌株形成細胞叢，這會降低涂板效率，一叢細胞在平板上只能長成一個菌落，使進一步的分析復雜化，在超聲水浴中對培養物進行3分鐘的超聲處理，可以減少該菌株的成叢性。

3. 將用過的方天鵝絨浸人水中過夜，用刷子輕輕刷洗以去掉殘渣，在干凈的水中漂洗干凈后，置于平面上晾干。由于酵母對肥皂和去污劑非常敏感，因此不要用它們來洗滌天鵝絨。

疑難解析：污染

1. 即使悉心按微生物無菌技術進行操作，有時培養物和培養基也會被污染。因此，平板和液體培養基在使用前要檢査，一旦污染就扔掉。

2. 酵母菌落有確定的形態特征和表面結構，平板或液體培養物有一種殘余的烘烤或釀造氣味。細菌污染通常導致腐臭味；真菌污染在平板上長成絲狀菌落，在液體培養基中形成毛茸茸的團塊。如果你認為培養物被污染，最好取點樣品涂在載玻片上并在顯微鏡下檢查。

3. 重要的酵母菌株可以通過從污染的平板上細心分離樣品并在新平板上劃線培養進行挽救。

本實驗來源《細胞實驗指南》 黃培堂 等譯。