一、材料1.動物一 年 中 的 問 一 時 間 在 不 同 米 樣 點 潮 落 時 采 集 貽 貝 Lmk，35?45 mm 長）或者是貝殼長度為 5 cm 的 紫 貽 貝 edwfe)。其中一個采樣點是有記錄的清潔區域，在這里采集到的動物作為對照。 2. 富含過氧化物酶體組分的分離在分離過程中所有緩沖液都需新鮮配制，并在冰浴中操作。
 3. 蛋白質的沉淀（1） 2 0 % (V/V) TCA (trichloroacetic acid) /冷丙酮， 0.07% (3-疏基乙醇。儲存于—20°C 的冰箱。 （2） 1 0 0 % 丙酮。儲存于一 20°C 的冰箱。 4. 促 溶 ，再水化（1）促溶緩沖液： 7 mol/L 尿素， 2 mol/L 硫脈， 2 % CHAPS， 0 . 5 % TritonX-100,1% β-巰基乙醇， l % Pharmalyte， 1 % DTT。 （2）再水化緩沖液： 8 mol/L 尿 素 ， 2 % CHAPS, 15 mmol/L D T T ， 1 % p-巰基乙醇 ， 0 . 2 % Pharmalyte0 （3）0? 95 mol/L IAA (碘代乙酰胺， iodoacetamide)。 5. 等電聚焦和平衡（1）平 衡 緩 沖 液（ EQ): 6 mol/L 尿素， 5 0 mmol/L T ris, 3 0 % 甘油， 2 % SDS，考馬斯亮藍， pH 8. 8。 （2） EQ 含 1 % 的 DTT。 （3）EQ 含 4 % 的 IAA。 6. SDS-PAGE這些裝置最好使用預制膠和標準類型的 12. 5 % Tris-HC1。如 果 SDS——PAGE 膠在實驗室自己準備的話，推薦用 I c m 厚度的膠。 （1）0.5 % 瓊脂糖在電泳緩沖液中溶解。 （2）電 泳 緩 沖 液（5 X ): 125 mmol/L Tris, 960 mmol/L 甘 氨 酸 ， 0 . 5 % SDS，pH 8. 3 7 .考馬斯亮藍染色（1） 固定液：甲醇-乙酸-水（45 : 1 : 54) （2）染色液： 1 7 % 硫酸銨， 3 4 % 甲醇， 3 % 磷酸， 0 . 1 % ( W/V ) 考馬斯亮藍 G250。 二、方法通過這種方法可以獲得由暴露于污染環境時表達發生改變的蛋白質構成的 PES。在野外實驗中，選擇一塊未被污染的區域作為對照區域對得到可靠的結果是必要的。理想化的條件是從對照和實驗區域中收集的動物應暴露于相同的生物（年齡 、貝殼大小等）和 非 生 物 條 件（鹽度、 pH、溫度等）中。 1. 富含過氧化物酶體組分的分離組織勻漿和通過碘克沙醇密度梯度離心分離亞細胞組分按已建立的方法（2 1 ) 進行并稍有改進。主 要亞細胞組分的命名是根據 Volkl 和 Fahimi 使 用 的 術 語（22)。因此，總勻漿被命名為 A ，重的線粒體組分稱為 B，輕的線粒體或富含過氧化物酶體的組分為D，胞質組分為 E ，微粒體組分為 F (圖 1)。
 （1）分 離 50 個貽貝的消化腺（約 5 g)。所有的采樣區域的實驗同時進行。 （2）按 3 mL/g (濕重）加人冰 HM 緩沖液，將組織在組織研磨器中研磨成小片狀 （3）使用松緊合適的研磨棒低速三次研磨獲得組織勻漿，將勻漿轉人試管中。 （4）用低速冷凍離心機 70 g 離 心 IOmin 以去除殘渣、未破碎的細胞和大部分細胞核。 （5）移走上清液，在沉淀中加入 2 m L /g 的 冰 HM 緩沖液，再次勻漿和離心。 （6）將第一次和第二次的上清液混合，作為組分 A 。 （7）在高速冷凍離心機中 1950 g 離心組分 A IOmiiu （8）離心后緩慢倒出上清液再次在 l 950 g 下離 心 8 min。最后的沉淀包括線粒體組分B 的主要部分，上清液為組分 C。 （9）把 上 清 液 成 分（組 分 C 在 39 O O O g 下 離 心 45 min，移 走 包 括 細 胞 質（組 分 E)和 微 粒 體（組 分 F) 的上清液；然后用玻璃棒將沉淀溶于 2 m L 的 冰 HM 緩沖液中。沉淀中包括了富含過氧化物酶體和輕線粒體的組分，即 D。 （10）將 I m L 組 分 D 小心地置于梯度液之上。梯度液包括 6 mL 2 8 % 碘 克 沙 醇（V/V )、 5 mmol/LMOPS、 0 . 1 % 乙醇、 lmmol/L EDTANa4 溶 液（pH7. 3 , 密度1.16 g/mL) 和 I mL 5 0 % 碘 克 沙 醇（V A O 、 5 mmol/L MOPS、 0.1 % 乙醇、I mmol/L EDTANa4 溶 液（密度 I.27 g/mL)。然后在 Beckman L7-55 離心機中使用 TFT50. 2T i 轉 子 在 40 OOOr/min (131 000 g )下 離 心 2 h。富含過氧化物酶體的組分將在 2 8 % 和 5 0 % 碘克沙醇溶液之間獲得。 （11）可采用生化方法評估獲得的富含過氧化物酶體組分。要盡量保證從不同采樣點提取的過氧化物酶體組分有相同的質量。否則，在任何樣本中摻雜的其他蛋白質污染將會干擾下一步的分析。在分離過程中可測量下列標記酶的活性：過氧化物酶體中的過氧化氫酶（catalase, CAT)、線 粒 體 的 號 拍 酸 脫 氫 酶（succinate dehydrogenase, SD) 和溶酶體的酸性憐酸酶（acidic phosphatase, AP) (23)。 蛋白質
濃度通過 Bradford 法 或 其 他 相 關 方 法 測 定（24)。另外 ，可應用不同的商業化多克隆抗體，使用經典的化學發光法來進行蛋白質凝膠印跡分析（圖 2)。
 2. 蛋白質沉淀（1） 為了沉淀樣本，需 將 I X 體積的 2 0% TCA (冷丙酮中，含 0.07% |3-巰基乙醇)與 I X 體積的樣本混合。 T C A 溶液必須新鮮配制。最后 T C A 濃度為 1 0 % 。 （2）在一 20°C 中至少沉淀 45 min。每 15 min 攪 拌 一 次（見注釋 3)。 （3）在冷凍離心機中以 12 000 g 離 心 10 min。 （4）去除上清液，然后以 12 OOOg 離心甩去剩余的 TCA, 否則它將影響 pH。 （5）用 I mL 冷 丙 酮（含 0. 0 7 % |3-巰基乙醇）清洗沉淀并混勻。然 后 以 12 000 g 在低溫下離心 lOmin。如果獲得的上清液還是黃色的話，重復這一步驟。 （6)去除上清液，以 12 OOOg 離心甩除丙酮。這樣可以減少干燥時間。 （7）在室溫下打開試管蓋干燥 20?30 min。可以用錫箔紙或類似的東西覆蓋管口以免灰塵或別的東西污染。 3. 溶解和再水化（1） 在沉淀樣本中加入促溶緩沖液。加入等于等電聚焦上樣量一半體積的促溶液。根據不同長度的 IPG 膠條，以下為推薦的上樣量： 7 cm 膠條， 125 uL ; 1lcm膠條 ， 1 8 5 uL ； 18 cm 膠條， 2 5 0 uL。同 時 加 人 1uL 0 . 0 1 % ( W /V ) CBB ，在室溫下振蕩 15 min。 （2）加入 O.95mol/L IA A ，使其終濃度為 30 mmol/L。在室溫下振蕩 15 min。此溶液需要新鮮配制。 （3）加人再水化緩沖液（即余下的一半體積），在室溫下振蕩 30 min。 （4）室溫下以 5000 g 離 心 lOmin。 （5）測定蛋白質濃度。通過任何方法如 Bradford 法（2 4 ) 或 Smith 法 （2 5 ) 來測定蛋白質濃度，推薦僅使用 1?2 uL 樣品。 （6）如果樣品無法馬上使用，建議將其保存于 4°C 冰箱。 4 .等電聚焦與平衡以下以使用 Bio-Rad 的 Portean IEF cell 為例。 （1）將上清液倒入聚焦盤中，將 IPG 膠條置于其上，注意膠條下不能有氣泡。 （2）等電聚焦方法： 對 于 11 cm 的 IPG 膠條：被動再水化 12?15 h，快速升壓。 第一步： 250V 15 min。 第二步： 8000V 2. 5 h。 第三步： 8000V 直到達到 35 000 V ? h (如必須，可達到 45 OOOV ? h)。 再水化后加人礦物油覆蓋膠條。 （3） 在等電聚焦后， IPG 膠條可以馬上平衡或儲存于一 20°C 冰箱中。 （4）室溫下將 IPG 膠條置于含有 1 % D T T 的平衡液中在搖床上平衡 15 min。 （5）室溫下將 IPG 膠條置于新的含有 4 % I A A 的平衡液中在搖床上平衡 15 min。IA A 需新鮮制備。 5 .SDS——PAGE 電泳以下操作以使用 Bio-Rad 的 Criterion SDS^PAGE cell 或 Dodeca cell 和 Criterion gel為 例（見 注 釋 4、注 釋 5)。 (1)將 IPG 膠條置于 SDS——PAGE 膠上，確保兩者之間沒有氣泡。 (2)加 人 0 . 5 % 的 瓊 脂 糖（溶于電泳緩沖液中）于膠條上，封住膠條。 (3)這一過程需在冷室中進行，用磁性攪拌棒保證電泳緩沖液維持在同一溫度。電泳緩沖液溫度應與室溫相同或更低。 (4) Ilcm 的膠在 120V 下直到 CBB 到達膠的底部。而 對 于 18 cm 的膠而言，需采用恒定的電流。在 前 30 min 采 用 16 mA，然后調電流至 24 mA 直 到 CBB 到達底部。 6 .考馬斯亮藍染色（1）在固定液中固定 30 min。 （2）在考馬斯亮藍中染色 12?18 min。 （3）在甲醇中脫色 2?3 min。 （4）在水中脫色 12 h 或直到背景清晰。多換幾次水更好，這樣背景更干凈。然后將膠保存于冷室中直到掃描分析或用質譜鑒定蛋白質（圖 3 、 圖 4)。
 7 .圖像獲取和分析（1） 可用 Amersham Biosciences 公司的 Image Scanner 掃描。 （2）數據通過 Amersham Bioscience 公司的 Image Master Platinum 6. 0 或市場上其他合適的軟件進行分析。 （3）圖像分析包括點的檢測、點的量化、標準化、背景去除和點的匹配，然后再進行統計學分析。 （4）每個蛋白質點的量通過點的體積來表達，定義為所有構成該點的像素密度的總和。 （5）為了校正 CBB 染色的差異，并反映出點之間量上的差異，點的體積進一步表示為該點占膠上所有點的體積的百分比。不同樣本間的所有點都通過這一百分比值進行顯著性分析。污染區樣本的 2-DE 圖譜可以與對照組進行對比。為了發現那些表達明顯改變（上調或下調） 的點，對兩個樣本進行 i 檢驗，只有顯著性為 9 5 % 或更高的蛋白質點才予以考慮。 展開 | 