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  • 發布時間:2019-03-26 17:56 原文鏈接: 基因置換實驗——構建融合蛋白

    實驗材料

    菌株BY4741質粒PDB118

    試劑、試劑盒

    磷酸鹽緩沖液

    儀器、耗材

    YPD 平板YPD 液體培養基血球計數板SC-his平板

    實驗步驟

    YPD 平板 第 1 天

    將菌株 7-3 在 YPD 平板上劃單克隆,30°C 下培養兩天。

    第 3 天

    挑取單克隆,在 5 mlYPD 液體培養基中培養,30°C 過夜。

    第 4 天

    使用血球計數板測定細胞密度(附錄 G)。將細胞稀釋至 5X106 個/ml,按照「技術和方案 1,酵母的高效轉化」進行高效轉化。兩個 DNA 樣品將被用作轉化。

    GFP 標記的 PCR 產物:lOOpl,含約 8pgPCR 產物。PCR 反應利用「技術和方案 14,PCR 介導基因破壞法」,使用質粒 PFA6a_GFP(S65T) 作模板、引物 NDCTAG1 和 NDCTAG2 進行。所得 DNA 將在 4 個單獨的轉化實驗中使用。

    降解決定子標簽的 BgZII 酶切的 PDB118: 約 lpg 的 pDB118 質粒經 n 酶切。

    這些 DNA 在一次轉化中使用。確定在轉化中含有一個陰性對照(不含 DNA)。

    將 GFP 標簽的轉化菌涂于 SC-his 平板上。將降解決定子標簽的轉化菌涂于含有 lOOpmol/LCuS04 的 HC-lira 平板上。23°C 培養 5 天。

    GFP 轉化

    第 7 天

    在單獨的 SC-hls 平板上將轉化子(10 個)重新克隆。

    第 10 天

    從每個轉化子中挑取一個菌落,按「技術和方案 15, 酵母菌落 PCR」作 GFP 融合鑒定。在反應中用四個不同的引物—引物 1?4。確定包括有來自菌株 7-3 細胞的作為對照。

    電泳分離 DNA,鑒定 GFP 融合。在 YPD 液體培養基中過夜培養 5 ml 細胞。

    第 11 天

    取 0.2 ml 新鮮的過夜培養液于 5 mlYPD 培養基中。30°C 培養細胞 4 h,獲得重新進入細胞周期的細胞。按「技術和方案 12, 酵母免疫熒光法」用甲醛固定細胞,但是將固定時間減少至 15 min。細胞染色,用 DAPI 標記 DNA,用 CY3 共軛二抗以抗微管蛋白染色法顯示微管。

    降解決定子轉化

    第 9 天

    將轉化子平板影印到 HC-ura 和含 100|umol/LCuS04 的 HC-ura 平板上。HC-ura 平板于 37°C 下培養,而含 lOO^mol/LCuS04 的 HC-ura 平板于 23°C 下培養。

    第 10 天

    統計 37°C 下培養的平板,鑒定 5 個溫度敏感型菌落。在 1 個含 100pmol/L CiiS04 的 HC-um 平板上復制 4 個候選菌落,于 23°C 下培養。

    第 14 天

    從每個轉化子中挑取一個菌落,按「技術和方案 15, 酵母菌落 PCR」作降解決定子融合鑒定。在反應中使用引物 A 和 B。確定包括有來自菌株 7-3 的細胞作為對照。電泳分離 DNA,鑒定一個含有降解決定子融合的菌落。在含 10(VmOl/LCUSO4 的 HClIra 培養基中過夜培養 5r^l 細胞。

    第 15 天

    取 0.2 ml 新鮮的過夜培養液于 5 ml 含 lOO/amol/LCuS04 的 HC-ura 培養基中。

    23°C 培養細胞 6 h,獲得重新進人細胞周期的細胞。取出 2.5 ml 細胞,離心后用無菌水清洗 2 次。清洗后的細胞于 HC-um 培養基中在 37°C 培養 4 h。將剩余細胞培養物放人 23°C,培養 4 h。按「技術和方案 12, 酵母免疫熒光法」用甲醛固定上述兩種方法處理的培養物細胞,但是將固定時間減少至 15 min。用 0.lmd/L 磷酸鉀緩沖液(pH7.5) 清洗細胞兩次。用 lmlO.lmol/L 磷酸鉀緩沖液(pH7.5) 重懸細胞于微離心管中,放置在冰箱中過夜。

    第 16 天

    按「技術和方案 12, 酵母免疫熒光法」,從程序 4 開始,對細胞染色,用 DAH 標記 DNA,用 CY3 共軛二抗以抗微管蛋白染色法顯示微管。


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