實驗材料 | |
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試劑、試劑盒 | |
儀器、耗材 | |
實驗步驟 | YPD 平板 第 1 天 將菌株 7-3 在 YPD 平板上劃單克隆,30°C 下培養兩天。 第 3 天 挑取單克隆,在 5 mlYPD 液體培養基中培養,30°C 過夜。 第 4 天 使用血球計數板測定細胞密度(附錄 G)。將細胞稀釋至 5X106 個/ml,按照「技術和方案 1,酵母的高效轉化」進行高效轉化。兩個 DNA 樣品將被用作轉化。 GFP 標記的 PCR 產物:lOOpl,含約 8pgPCR 產物。PCR 反應利用「技術和方案 14,PCR 介導基因破壞法」,使用質粒 PFA6a_GFP(S65T) 作模板、引物 NDCTAG1 和 NDCTAG2 進行。所得 DNA 將在 4 個單獨的轉化實驗中使用。 降解決定子標簽的 BgZII 酶切的 PDB118: 約 lpg 的 pDB118 質粒經 n 酶切。 這些 DNA 在一次轉化中使用。確定在轉化中含有一個陰性對照(不含 DNA)。 將 GFP 標簽的轉化菌涂于 SC-his 平板上。將降解決定子標簽的轉化菌涂于含有 lOOpmol/LCuS04 的 HC-lira 平板上。23°C 培養 5 天。 GFP 轉化第 7 天 在單獨的 SC-hls 平板上將轉化子(10 個)重新克隆。 第 10 天 從每個轉化子中挑取一個菌落,按「技術和方案 15, 酵母菌落 PCR」作 GFP 融合鑒定。在反應中用四個不同的引物—引物 1?4。確定包括有來自菌株 7-3 細胞的作為對照。 電泳分離 DNA,鑒定 GFP 融合。在 YPD 液體培養基中過夜培養 5 ml 細胞。 第 11 天 取 0.2 ml 新鮮的過夜培養液于 5 mlYPD 培養基中。30°C 培養細胞 4 h,獲得重新進入細胞周期的細胞。按「技術和方案 12, 酵母免疫熒光法」用甲醛固定細胞,但是將固定時間減少至 15 min。細胞染色,用 DAPI 標記 DNA,用 CY3 共軛二抗以抗微管蛋白染色法顯示微管。 降解決定子轉化第 9 天 將轉化子平板影印到 HC-ura 和含 100|umol/LCuS04 的 HC-ura 平板上。HC-ura 平板于 37°C 下培養,而含 lOO^mol/LCuS04 的 HC-ura 平板于 23°C 下培養。 第 10 天 統計 37°C 下培養的平板,鑒定 5 個溫度敏感型菌落。在 1 個含 100pmol/L CiiS04 的 HC-um 平板上復制 4 個候選菌落,于 23°C 下培養。 第 14 天 從每個轉化子中挑取一個菌落,按「技術和方案 15, 酵母菌落 PCR」作降解決定子融合鑒定。在反應中使用引物 A 和 B。確定包括有來自菌株 7-3 的細胞作為對照。電泳分離 DNA,鑒定一個含有降解決定子融合的菌落。在含 10(VmOl/LCUSO4 的 HClIra 培養基中過夜培養 5r^l 細胞。 第 15 天 取 0.2 ml 新鮮的過夜培養液于 5 ml 含 lOO/amol/LCuS04 的 HC-ura 培養基中。 23°C 培養細胞 6 h,獲得重新進人細胞周期的細胞。取出 2.5 ml 細胞,離心后用無菌水清洗 2 次。清洗后的細胞于 HC-um 培養基中在 37°C 培養 4 h。將剩余細胞培養物放人 23°C,培養 4 h。按「技術和方案 12, 酵母免疫熒光法」用甲醛固定上述兩種方法處理的培養物細胞,但是將固定時間減少至 15 min。用 0.lmd/L 磷酸鉀緩沖液(pH7.5) 清洗細胞兩次。用 lmlO.lmol/L 磷酸鉀緩沖液(pH7.5) 重懸細胞于微離心管中,放置在冰箱中過夜。 第 16 天 按「技術和方案 12, 酵母免疫熒光法」,從程序 4 開始,對細胞染色,用 DAH 標記 DNA,用 CY3 共軛二抗以抗微管蛋白染色法顯示微管。 |
肌球蛋白myosin與微絲actin形成具有收縮性的肌動肌球蛋白束,在肌肉細胞中以肌小節形式存在,在非肌肉細胞中以微絲應力纖維形式存在,是細胞定向運動的動力結構,特別對癌細胞的轉移、免疫細胞的靶向運動......
當得知兒子Max患有癌癥后,AriellaRitvo沖進醫院病理室,要求親自查看結果。“我不會走,我有一個16歲的患者躺在這,我希望證實這一切。”她告訴驚訝的病理學家。面對顯微鏡下被染成藍色的大量細胞......
記者29日從國家“863”計劃項目課題組了解到,我國“人類乳頭瘤病毒(HPV)融合蛋白疫苗”研發取得重要進展,即將進入臨床試驗階段。“人類乳頭瘤病毒(HPV)融合蛋白疫苗”項目為國家“863”計劃項目......
近日,沃森生物控股子公司上海澤潤生物科技有限公司持股92.5%的上海澤潤安珂生物制藥有限公司收到了“Materialwithimmunogenicity”(具有免疫原性的物質)美國發明ZL授權證書。Z......
日前,江蘇弗泰生物科技有限公司的融合蛋白試劑獲得泰州海關出境通關許可,遠銷美國,成為國內首批經過海關允許出口的同類試劑。據介紹,融合蛋白是目前世界上為數很少的以抑制為作用機理的重組藥物,廣泛應用于自身......
摘要為構建表達組織因子(TF)膜外區的融合載體,制備組織因子膜外區,抽提人胎盤組織的總RNA,通過RT2PCR法擴增出TF的cDNA克隆至pUC18并測定全序列L然后以此為模板,再次PCR擴增出TF膜......
摘要:通過搖瓶培養對含有Thymosinα1基因的重組pET32a質粒的工程菌BL21的生長和融合蛋白表達進行了研究。選擇LB和TH培養基,考察了培養溫度、搖瓶中培養基盛裝量、葡萄糖添加量、誘導劑IP......
摘要:利用原核表達載體pGEX24T21構建重組質粒載體pGEX2HAL1,三親本雜交轉化根瘤菌,表達融合蛋白GST2HAL1。結果表明,與空白菌和未誘導工程根瘤菌相比,誘導后工程根瘤菌的耐鹽水平有明......
為了提高鼓精蛋白基因工程菌融合蛋白的表達童,本文時工程菌的發酵培養基組分、培養墓初始值、發酵種子接種童、誘導劑濃度、誘導溫度、誘導時機、誘導時間子因子進行了篩選。......