| 實驗步驟 | 第 1 天
將菌株 7-2 在 YPD 平板上劃線，30°C 培養。
第 3 天
挑一個豐滿的菌株 7_2 菌落，接種到 5 mlYPD 培養液，30°C 下培養過夜。
第 4 天
使用血球計數板（附錄 G，用標準血球計數板進行酵母細胞計數）測定 5 ml 菌株 7-2 培養物的細胞密度。用 50 mlYPD 培養液將細胞稀釋至 5X106 個/ml，置 30°C 培養細胞到兩次分裂（約 4 h)。按照「技術和方案 1，酵母的高效轉化」收獲細胞，用 lOOng 誘變的 PDB141 質粒進行轉化（提供的母液用技術和方案 7, 質粒 DNA 的羥胺突變或經 XL-1 紅色菌株細胞誘變制得）。必須包括一個不加 DNA 的陰性對照。這里將對「技術和方案 1，酵母的高效轉化」有一個小的改進。改進步驟 16: 用已滅菌的蒸餾水 2.5 ml 重懸轉化細胞（濃縮的細胞）。吸出 0.4 ml 濃縮的細胞稀釋到 2.0 ml(稀釋的細胞）。取 0.2 ml 涂 HC-ieu 平板，用濃縮的細胞懸液涂 10 個板，用稀釋的細胞涂另外 10 個板。把0.2 ml 不加 DNA 的陰性對照的濃縮細胞涂在一個平板上。所有 21 個平板在 23°C 下培養。
第 9 天
選擇 10 個轉化平板，理想情況下，每個平板有 100~300 個菌落，計算菌落總數。
把 10 個 HC-leu 轉化平板分別影印到 5-FOA 平板上。保留主要的平板（HC-leu)，23°C 下培養。
第 11 天
測定在 FOA 抑制下無法生長的菌落片段。把 FOA 平板分別影印到兩塊 YPD 平板和一塊含有 15jug/ml 苯的 YPD 平板。一塊 YPD 平板于 37°C 下培養，另一塊 YPD 平板和 YPD+苯平板于 23°C 下培養。
第 12 天
統計 37°C 下影印平板的溫度敏感型候選菌落。從 23°C 下培養的 YPD 平板上挑 12 個溫度敏感型候選菌落，劃線到 YPD 平板于 23°C 下培養純化（最多使用 3 塊 YPD 平板)。
第 13 天
統計 23°C 下培養的含苯平板的苯敏感和無法生長或生長不好的菌落。挑 12 個候選菌落，劃線到 YPD 平板于 23°C 下培養純化（最多使用 3 塊 YPD 平板）。注意任何既是苯敏感也是溫度敏感的菌落。
第 16 天
實驗七基因置換?59?
在 YPD+苯平板和兩塊 YPD 平板上分別再次測定純化的候選菌落的苯敏感性和溫度敏感性。一塊 YPD 平板于 23°C 下培養，另一塊于 37°C 下培養。
第 17 天
統計 37°C 下培養平板上的溫度敏感型菌落。統計 23°C 下培養的含苯平板上的菌落，將平板保存至第 2 天。
第 18 天
統計含苯平板上的菌落，測定每種突變體的頻率。 |
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