核酸活性多肽及遞質的提取方法

　核酸分為兩大類：一類為核糖核酸（RNA），另一類為脫氧核糖核酸（DND）。核酸的分子量極大，人數萬致億萬。核酸是兩性化合物，在一定的等電點。溶于水，其水溶液呈酸性，不溶于乙醇等有機溶劑。細胞內的核酸常和蛋白質結合成核蛋白。核糖核蛋白和脫氧核糖核蛋白在不同濃度的電解質溶液中的溶解度有顯著區別，有一定濃度范圍的氯化鈉溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度隨著氯化鈉濃度增加而逐漸下降，當氯化鈉濃度為0.14mol/L時，其溶解度僅為水中溶解度的1/100，但當氯化鈉濃度再增加時，脫氧核糖核蛋白的溶解度重新增加，氯化鈉濃度增加到0.5mol/L時，其溶解度與水中溶解度相似，當氯化鈉濃度增加到1mol/L時，它的溶解度比在水中大2倍。核糖核蛋白在0.14mol/L氯化鈉溶液中仍有相當大的溶解度，因此常用0.14mol/L氯化鈉溶液提取核糖核蛋白，而提取脫氧核糖核蛋白時，則用1mol/L氯化鈉溶液。兩種核糖核蛋白的溶解度與溶液的pH也有關。當pH為4.2時，脫氧糖核蛋白的溶解度zui低，而pH為2.0～2.5時，核糖核蛋白的溶解度zui低。所以調節氯化鈉溶液的濃度和pH值，可使核糖核蛋白和脫氧核糖核蛋白分離開來。 

　　（1）RNA的提取：RNA在細胞中主要有三種類型，即rRNA（核微粒核糖核酸）、tRNA（轉移核糖核酸）和mRNA（信使核糖核酸）。mRNA代謝極不穩定，提取時要求條件較嚴格；tRNA當細胞破碎后，用酸處理得到“pH5”沉淀，即可從中分離tRNA；rRNA占全部RNA的80%以上，比較穩定，一般提取的大分子RNA主要為此部分。核內rRNA常先將細胞核分離后，再進行提取，可避免其他細胞組分RNA的干擾。 
　　RNA的提取，通常是用0.14mol/L氯化鈉溶液將組織做勻漿并反復提取細胞質中的核糖核蛋白，而留下含有DNA的細胞核物質，然后用10%醋酸調至pH4.2沉淀，離心棄去上清液，先用0.5mol/L氯化鈉溶液，后用水洗滌沉淀，將核糖核蛋白后溶解于0.5mol/L碳酸氫鈉溶液中，離心，取上清液，調pH至4.2,沉淀以0.5mol/L氯化鈉溶液洗滌，再一次除去脫氧核糖核蛋白。核糖核蛋白中的蛋白質可用含有少量辛醇的氯仿抽提除去，核酸留在碳酸氫鈉水溶液中，加入乙醇，RNA即以鈉鹽形式沉淀出來。 
　　提取RNA另一類方法，不須事先用0.14mol/L氯化鈉提取核糖核蛋白，而一步將RNA的蛋白質分開，并同時把RNA抽提出來，此類方法是在破碎細胞做成勻漿時，加入去污劑十二烷基磺酸鈉或二甲苯磺酸鈉；而現在zui常用的方法是直接加入含水苯酚與勻漿一起振蕩，DNA和蛋白質沉淀于酚層中，水層中含RNA和多糖，然后用乙醇使RNA沉淀，四種物質一步便可初步分離開。苯酚法是目前提取不降解的RNAzui有效的方法，其應用舉例如下： 
　　肝臟rRNA的提取：按肝重（鮮）加入10倍容積苯酚-甲酚混合液（500g苯酚及70ml n-甲酚于50ml蒸餾水中，另加入0.5g 8-羥基喹啉配成）及10倍容積的0.5%萘-1，5-二磺酸水溶液（g/V）做勻漿后在20℃攪拌20min。 
　　肝臟細胞核內mRNA的提取：先分離細胞核，再將核懸浮于3倍容積的0.5%pH6.5的萘二磺酸水溶液（g/V）中勻漿后加入等量90%（g/V）苯酚水溶液（內含0.1%8-羥基喹啉）在2℃振蕩提取30min。 
　　酵母tRNA的提取：100g酵母（濕重）加入200ml水，300ml 90%苯酚水溶液，振蕩2h,4℃冰箱中過液，使之提取完全。 
　　以上介紹了用冷酚法提取各種RNA的一些實例，近來還有皂土酚法（即除苯酚外還加入皂土吸附蛋白質）提取RNA，據報道比普通酚法提取RNA的生物活性高10倍左右。但應用苯酚法提取核酸時，須注意市售苯酚常含有少量重金屬和雜質，可能導致核酸降解，使用時，一般需要減壓重蒸。 

　　（2）DNA的提取：DNA主要存在于細胞核中，天然狀態的DNA絕大多數是以脫氧核糖核蛋白形式存在。人細胞中提取DNA時，一般先獲得脫氧核糖核蛋白，再將蛋白質除去，從中分離DNA。常用的方法是以1mol/L氯化鈉溶液抽提，得到的脫氧核糖核蛋白溶液與含有少量辛酸或戊醇的氯仿一起振蕩，除去蛋白質。或者在組織細胞破碎后以低濃度0.14mol/L氯化鈉溶液（也可用0.1mol/L氯化鈉加0.05mol/L檸檬酸代替）反復洗滌除去核糖核蛋白，再以1mol/L氯化鈉提取脫氧核糖核蛋白，提取仍按氧仿-戊醇抽提法除去蛋白質。兩種方法比較，后一種方法使核酸降解可能少一些。以稀鹽溶液提取DNA時，加入適量去污劑更有助于蛋白質與DNA的分離。 
　　應用苯酚法也可以提取DNA而且不用經過脫氧核糖核蛋白這一步驟，例如大鼠肝勻漿在6%對氨基水楊酸鹽溶液內，加入同體積90%苯酚水溶液，室溫下提取1h，再經進一步提純可獲得98%～99%純度的DNA。苯酚法也是目前提取DNAzui常用的方法之一。 

　　（3）活性多肽及遞質的提取 
大體上與蛋白質的提取方法相似，可參照進行。經典神經遞質如去甲腎上腺素、腎上腺素、乙酰膽堿、5-羥色胺等均可化學合成，無需用很多精力去提取。